មើល៖ 0 អ្នកនិពន្ធ៖ កម្មវិធីនិពន្ធគេហទំព័រ ពេលវេលាបោះពុម្ព៖ 2026-04-24 ប្រភពដើម៖ គេហទំព័រ
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) នៅតែជាស្តង់ដារសម្រាប់ការបន្សុតប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាករបស់គាត់ទូទាំងពិភពលោក។ ប៉ុន្តែអ្នកស្រាវជ្រាវជារឿយៗប្រឈមមុខនឹងបញ្ហាដ៏គួរឱ្យធុញទ្រាន់ក្នុងអំឡុងពេលនីតិវិធីមន្ទីរពិសោធន៍ជាប្រចាំ។ ពួកគេសង្កេតមើលការប្រមូលផ្តុំនៅខាងក្រោមទឹកដែលមិនបានរំពឹងទុក ការបាត់បង់មុខងារអង់ស៊ីមភ្លាមៗ និងការបំបែកស្មុគស្មាញដែលមិនចង់បាន។ អ្នកប្រហែលជាឆ្ងល់ថាតើសារធាតុ elution របស់អ្នកបំផ្លាញយ៉ាងសកម្មនូវគោលដៅដែលបានសម្តែងដោយប្រុងប្រយ័ត្នរបស់អ្នក។ ការពិតទាមទារឱ្យមានការយល់ដឹងខ្ពស់។ គីមី imidazole មិនមែនជាឱសថបុរាណដូចជា អ៊ុយ ឬ ហ្គានីឌីន ទេ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វាងាយនឹងធ្វើឱ្យរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីនឆ្ងាញ់ៗស្ថិតក្រោមលក្ខខណ្ឌពិសោធន៍ជាក់លាក់។ កំហាប់ខ្ពស់ដែលមិនមានការប៉ះទង្គិច ភាពតានតឹងកម្ដៅ ឬការប៉ះពាល់រយៈពេលយូរ ធ្វើឱ្យរំខានដល់អន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីនសំខាន់ៗ។ យើងបានរចនាអត្ថបទនេះដើម្បីផ្តល់នូវក្របខ័ណ្ឌដែលមានមូលដ្ឋានលើភស្តុតាងច្បាស់លាស់សម្រាប់មន្ទីរពិសោធន៍របស់អ្នក។ អ្នកនឹងរៀនពីរបៀបកំណត់ឱ្យបានត្រឹមត្រូវនូវការខូចខាតរចនាសម្ព័ន្ធដែលបណ្ដាលមកពីសតិបណ្ដោះអាសន្ន។ យើងនឹងបង្ហាញអ្នកយ៉ាងច្បាស់ពីរបៀបធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវការបណ្ដោះអាសន្នការបន្សុតរបស់អ្នក។ ជាចុងក្រោយ យើងនឹងវាយតម្លៃវេទិកាជំនួសដែលមានសុវត្ថិភាពជាងមុន ដើម្បីការពារការវាយតម្លៃខាងក្រោមដែលងាយរងគ្រោះ។
កម្រិតនៃការផ្តោតអារម្មណ៍៖ ជាទូទៅការប្រមូលផ្តុំ elution ស្តង់ដារ (50–250 mM) គឺមានសុវត្ថិភាព ប៉ុន្តែការប្រមូលផ្តុំខ្លាំង (~1M) បញ្ចេញឥទ្ធិពលដូចអំបិលខ្លាំង ដែលរំខានដល់អន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនដែលសម្របសម្រួលដោយបន្ទុក។
ហានិភ័យនៃការថយចុះកម្តៅ៖ ការស្ងោរសំណាកប្រូតេអ៊ីនដែលមានផ្ទុក imidazole សម្រាប់ SDS-PAGE បណ្តាលឱ្យមានអ៊ីដ្រូលីស្យូមនៃចំណងអាស៊ីត-labile ដែលនាំទៅដល់ការរិចរិលគោលដៅ។
ការជ្រៀតជ្រែកក្នុងការវិភាគ៖ Imidazole ស្រូបពន្លឺ UV យ៉ាងខ្លាំងនៅកម្រិត 280 nm (បណ្តាលឱ្យទិន្នន័យទិន្នផលវិជ្ជមានមិនពិត) និងរំខានដល់ការវិភាគដែលមានមូលដ្ឋានលើទង់ដែង (Lowry, Biuret) ។
ជម្មើសជំនួសនៃដំណើរការ៖ ការផ្លាស់ប្តូរទៅជ័រដែលមានមូលដ្ឋានលើ Cobalt បន្ថយកំហាប់ imidazole ដែលត្រូវការ ខណៈពេលដែលម៉ាទ្រីសស៊ីលីកា/លីស៊ីនថ្មីជាង លុបបំបាត់តម្រូវការសម្រាប់ imidazole ទាំងស្រុង។
ក្រុមមន្ទីរពិសោធន៍ជារឿយៗមានការតស៊ូក្នុងការបែងចែករវាងអស្ថិរភាពគោលដៅធម្មជាតិ និងការប្រែពណ៌ដែលបណ្តាលមកពីសតិបណ្ដោះអាសន្ន។ ការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យខុសលើបញ្ហាជាក់លាក់នេះនាំឱ្យទិន្នន័យជីវវិទ្យារចនាសម្ព័ន្ធមានការសម្របសម្រួល។ វាក៏ទាមទារការដំណើរការសាកល្បងឡើងវិញដ៏ទូលំទូលាយ និងចំណាយពេលវេលាផងដែរ។ ការយល់ច្បាស់អំពីរបៀបដែលសតិបណ្ដោះអាសន្នប៉ះពាល់ដល់ប្រូតេអ៊ីនរបស់អ្នកការពារការបរាជ័យប្រតិបត្តិការសំខាន់ៗទាំងនេះ។
ដំណោះស្រាយភាគហ៊ុនដែលមិនបានកែតម្រូវគឺមានជាតិអាល់កាឡាំងខ្ពស់នៅក្នុងខ្លួន។ ការខកខានមិនបានធ្វើ titrate elution buffers ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ បណ្តាលឱ្យមាន pH កើនឡើងភ្លាមៗ នៅពេលអនុវត្តជួរឈរ។ ការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងខ្លាំងនេះបង្កឱ្យមានការលាតត្រដាងមូលដ្ឋានីយកម្មនៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទីបី។ ស្មុគ្រស្មាញប្រូតេអ៊ីនឆ្ងាញ់បំបែកយ៉ាងឆាប់រហ័សនៅក្នុងបរិយាកាសដ៏អាក្រក់បែបនេះ។ តែងតែផ្ទៀងផ្ទាត់ pH សតិបណ្ដោះអាសន្នរបស់អ្នកឱ្យបានហ្មត់ចត់ មុននឹងបន្តជំហាន elution ណាមួយ។
ការប្រមូលផ្តុំច្រើនពេកបង្ហាញពីការគំរាមកំហែងលាក់កំបាំងដ៏គ្រោះថ្នាក់មួយទៀតចំពោះភាពសុចរិតគំរូ។ នៅពេលដែលកម្រិត molar ខិតជិត 1M ដំណោះស្រាយមានឥរិយាបទទាំងស្រុងជាសារធាតុរំលាយដែលមានកម្លាំងអ៊ីយ៉ុងខ្ពស់។ ឥទ្ធិពល 'អំបិលខ្ពស់' បញ្ចេញសម្លេងនេះ រំខានដោយផ្ទាល់ដល់អន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្តាតខ្សោយ។ ចំណងប៉ូលដែលចាំបាច់សម្រាប់រក្សាការអនុលោមតាមដើមបានបំបែកទាំងស្រុង។ វាផ្លាស់ប្តូរសែលជាតិទឹកជុំវិញម៉ូលេគុលប្រូតេអ៊ីន។ អាស្រ័យហេតុនេះ អន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីនសំខាន់ៗ (PPIs) បរាជ័យក្នុងការប្រមូលផ្តុំពហុមេរិករួមគ្នា។
ជាចុងក្រោយ ការបន្តការភ្ញាស់ក្រោយការវិវត្តន៍ ជំរុញឱ្យមានការរសាត់តាមទម្រង់យឺត។ ប្រូតេអ៊ីនគោលដៅអាចឆាប់ចេញពីដំណោះស្រាយតាមពេលវេលា។ អ្នកអាចកត់សម្គាល់ការប្រមូលផ្តុំដ៏ធ្ងន់ដែលកើតឡើងក្នុងអំឡុងពេលលាងឈាមជាបន្តបន្ទាប់ ឬជំហានផ្ទុករយៈពេលវែង។ ដំណើរការប្រភាគដែលអ្នកចង់បានកំណត់ភ្លាមៗនូវបង្អួចដែលមានការប៉ះពាល់ដ៏គ្រោះថ្នាក់នេះ។ ការលុបចោលភ្លាមៗធានាថាប្រូតេអ៊ីនរបស់អ្នករក្សាបាននូវស្ថានភាពដើមមុខងារដែលមានបំណង។
គម្លាតពិធីការជាញឹកញាប់បំផ្លាញការបន្សុតដែលដំណើរការយ៉ាងល្អឥតខ្ចោះ។ យើងបានរកឃើញកំហុសនីតិវិធីធំៗចំនួនបីដែលបង្កឱ្យមានការប្រែពណ៌ដោយមិនចង់បាន។ ការជៀសវាងកំហុសទាំងនេះ ធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវភាពស៊ីសង្វាក់នៃការពិសោធន៍របស់អ្នក។
កំហុសទី 1៖ គំរូកំពុងពុះសម្រាប់ SDS-PAGE ។
ហានិភ័យ៖ អ្នកស្រាវជ្រាវតែងតែស្ងោរសំណាកនៅសីតុណ្ហភាព 100°C មុនពេលដំណើរការជែល។ សំណាកឆ្អិនដោយផ្ទាល់ដែលមានកំហាប់ elution ខ្ពស់បំបែកចំណងអាស៊ីត-labile ឆ្ងាញ់។ កម្រិតខ្ពស់នៃសារធាតុ reagent បង្កើនល្បឿនអ៊ីដ្រូលីស៊ីសដែលបំផ្លិចបំផ្លាញនេះយ៉ាងខ្លាំង។ អ្នកនឹងឃើញការបំផ្លាញក្រុមដែលអាចមើលឃើញដោយជៀសមិនរួច និងការលាបលើជែលលទ្ធផលរបស់អ្នក។
ជួសជុល៖ ដាក់សំណាករបស់អ្នកនៅសីតុណ្ហភាព 70°C ក្នុងរយៈពេល 5 នាទីជំនួសវិញ។ វិធីសាស្រ្តកំដៅដ៏ទន់ភ្លន់នេះការពារប្រូតេអ៊ីនដោយសុវត្ថិភាពសម្រាប់ electrophoresis ដោយមិនបង្កឱ្យមានការបំផ្លាញសារធាតុគីមី។ អ្នកសម្រេចបានក្រុមតន្រ្តីច្បាស់លាស់ និងត្រឹមត្រូវតំណាងឱ្យទិន្នផលពិតប្រាកដរបស់អ្នក។
កំហុសទី 2៖ ការពឹងផ្អែកលើការប្រមូលផ្តុំ Imidazole ដើម្បីដោះស្រាយបញ្ហាមិនបរិសុទ្ធ។
ហានិភ័យ៖ ពេលខ្លះប្រតិបត្តិកររុញច្រាន elution buffers លើសពី 500 mM ដោយមិនចាំបាច់។ ពួកគេព្យាយាមបង្ខំគោលដៅរឹងរូសចេញពីជួរឈរ ជាជាងបង្កើនប្រសិទ្ធភាពការចង។ វិធីសាស្រ្តប្រើដៃធ្ងន់នេះ ដកស្ថេរភាពអ៊ីយ៉ុងដែកពី metalloproteins បង្កើត apoproteins ដែលមិនមានមុខងារ។ វាក៏បង្កើនហានិភ័យនៃការពុលកោសិកាផងដែរ សម្រាប់ការវាយតម្លៃនៅក្នុង vivo ខាងក្រោម។
ការជួសជុល៖ កែលម្អជំហានលាងសម្អាតបឋមរបស់អ្នក ជំនួសឱ្យការបង្កើនភាពរឹងមាំនៃការបញ្ចេញពន្លឺ។ ដោះស្រាយការចងមិនជាក់លាក់ដោយការផ្គូផ្គងបរិមាណជួរឈរ (CV) យ៉ាងតឹងរឹងទៅនឹងបន្ទុកប្រូតេអ៊ីនពិតប្រាកដ។ ការបន្ថែម 200-500 mM Arginine ផ្តល់នូវការរំខានអេឡិចត្រូស្តាតដ៏ល្អនៃសារធាតុមិនបរិសុទ្ធ។ ម៉្យាងទៀត ការលាងសម្អាតជាមួយនឹង 1-4 mM ATP ដោយជោគជ័យបញ្ចេញនូវសារធាតុប្រឆាំងម៉ូលេគុលដែលបន្សុតរួមគ្នាចេញពីគោលដៅរបស់អ្នក។
កំហុសទី 3៖ ការមិនអើពើនឹងរដ្ឋប្រូតុង Histidine ។
ហានិភ័យ៖ pH សតិបណ្ដោះអាសន្នគ្រប់គ្រងយន្តការចងរាងកាយទាំងស្រុង។ ទម្លាក់ pH ទាបពេក កំឡុងពេលចង ឬបោកគក់ ការពារការបំលែងសារធាតុ Histidine ដ៏សំខាន់។ ការចូលទៅជិតចំនុច isoelectric នាំទៅដល់ការបំភាន់គោលដៅមុនអាយុ។ ប្រូតេអ៊ីនអាចធ្លាក់ចេញពីជ័រនៅកំហាប់ទាបបំផុត ជួនកាលត្រឹមតែ 10 mM ប៉ុណ្ណោះ។ នេះបង្ខំឱ្យប្រតិបត្តិករផ្លាស់ប្តូរពិធីការស្តង់ដារប្រកបដោយគ្រោះថ្នាក់ដោយគ្រាន់តែចាប់យកទិន្នផលរបស់ពួកគេ។ អ្នកត្រូវតែធានាថា pH សតិបណ្ដោះអាសន្នរបស់អ្នកនៅដដែល ឬលើសពី 7.5 ដើម្បីរក្សាស្ថានភាពបន្ទុកត្រឹមត្រូវ។
អ្នកត្រូវតែវាយតម្លៃថាតើសមាសធាតុសតិបណ្ដោះអាសន្នដែលនៅសេសសល់ធ្វើឱ្យមានការវាយតម្លៃការវិភាគចុះក្រោម។ ការវាស់វែងមិនត្រឹមត្រូវបំផ្លាញដំណាក់កាលពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់ និងខ្ជះខ្ជាយធនធានមន្ទីរពិសោធន៍ដ៏មានតម្លៃ។
វិមាត្រវាយតម្លៃ៖ ភាពត្រឹមត្រូវនៃបរិមាណ
សារធាតុនេះបង្ហាញពីលក្ខណៈស្រូបយកកាំរស្មីយូវីខាងក្នុងដ៏ខ្លាំងមិនធម្មតា។ សតិបណ្ដោះអាសន្ន elution 250 mM ធម្មតាបង្កើតផ្ទៃខាងក្រោយ $A_{280}$ ចាប់ពី 0.2 ដល់ 0.4 ។ បាតុភូតរូបវន្តនេះបំប៉ោងការគណនាទិន្នផលគោលដៅយ៉ាងសំខាន់។ អ្នកប្រហែលជាគិតថាអ្នកបានផលិតប្រូតេអ៊ីនច្រើនជាងអ្វីដែលមាននៅក្នុងបំពង់។
យុទ្ធសាស្ត្រកែតម្រូវ៖ តែងតែទទេ spectrophotometer របស់អ្នកយ៉ាងម៉ត់ចត់។ អ្នកត្រូវតែប្រើសមាសភាពពិតប្រាកដនៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន elution ជាឯកសារយោងរបស់អ្នកទទេ។ ម៉្យាងទៀត ផ្លាស់ប្តូរលំហូរការងាររបស់អ្នកទៅការវាយតម្លៃ Bradford ។ វិធីសាស្រ្តដែលមានមូលដ្ឋានលើ Coomassie ដែលអាចទុកចិត្តបាននេះទប់ទល់នឹងការជ្រៀតជ្រែកអុបទិកជាក់លាក់បែបនេះប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់។ អ្នកគួរតែជៀសវាងទាំងស្រុងនូវវិធីសាស្ត្រកាត់បន្ថយទង់ដែងដូចជា Lowry និង Biuret assay។ សារធាតុគីមីនេះកាត់បន្ថយអ៊ីយ៉ុងទង់ដែង ដែលបណ្តាលឱ្យមានការបរាជ័យក្នុងបរិមាណដ៏ធំ។
វិមាត្រវាយតម្លៃ៖ ការវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធ និងមុខងារ
ម៉ូលេគុលដែលនៅសេសសល់ប្រកួតប្រជែងយ៉ាងខ្លាំងក្លាសម្រាប់កន្លែងភ្ជាប់លោហៈដែលរកឃើញនៅក្នុង metalloenzymes ស្មុគស្មាញ។ លើសពីនេះ ពួកវាអាចដើរតួជាអ្នករំខានដល់ប្រព័ន្ធ endocrine ដ៏ខ្លាំងក្លានៅក្នុងការវាយតម្លៃលើកោសិការសើប ឬនៅក្នុង vivo វិភាគ។ ការទុកវាឱ្យចរាចរនៅក្នុងគំរូរបស់អ្នកដោយផ្ទាល់ ធ្វើឱ្យប៉ះពាល់ដល់ភាពពាក់ព័ន្ធខាងសរីរវិទ្យា និងភាពត្រឹមត្រូវនៃទិន្នន័យរចនាសម្ព័ន្ធ។
ពិធីការដកយកចេញ៖ នៅពេលវាយតម្លៃលទ្ធភាពជីវសាស្រ្តនៅខាងក្រោមទឹក កំណត់ការដកសំណល់ចេញភ្លាមៗ។ ប្រើប្រាស់ជួរឈរដកការដកចេញទំហំរហ័សសម្រាប់ពេលវេលាផ្លាស់ប្តូររហ័ស។ តម្រង centrifugal ultrafiltration និងការលាងឈាមពេញមួយយប់ក៏ដំណើរការបានយ៉ាងល្អជាពិសេសសម្រាប់ការសម្អាតគំរូយ៉ាងហ្មត់ចត់មុនពេលធ្វើតេស្តអង់ស៊ីម។
ប្រភេទនៃការវិភាគ |
កម្រិតជ្រៀតជ្រែក |
យន្តការនៃការជ្រៀតជ្រែក |
អនុសាសន៍ |
|---|---|---|---|
A280 (ស្រូបកាំរស្មីយូវី) |
ខ្ពស់។ |
ការស្រូបយកខាងក្នុងខ្លាំងនៅ 280 nm |
ទទេដោយប្រុងប្រយ័ត្នឬជៀសវាង |
Bradford (Coomassie) |
ទាប |
អន្តរកម្មតិចតួចបំផុតជាមួយនឹងការចងពណ៌ |
ផ្តល់អនុសាសន៍ខ្ពស់។ |
Lowry / Biuret |
ធ្ងន់ធ្ងរ |
កាត់បន្ថយទង់ដែងការពារការផ្លាស់ប្តូរពណ៌ |
កុំប្រើ |
ការកាត់បន្ថយការប៉ះពាល់យ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាពការពារទិន្នផលមុខងារចុងក្រោយរបស់អ្នក។ អ្នកអាចបង្កើនប្រសិទ្ធភាពដំណើរការមន្ទីរពិសោធន៍ដោយប្រើយុទ្ធសាស្រ្តកំណត់គោលដៅខ្ពស់មួយចំនួន។
ដំណោះស្រាយប្រភេទទី 1៖ ប្តូរទៅប្រព័ន្ធ IMAC ដែលមានមូលដ្ឋានលើ Cobalt
ជ័រ Cobalt បង្ហាញពីភាពជាក់លាក់គោលដៅខ្ពស់ជាងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងម៉ាទ្រីស Ni-NTA ស្តង់ដារ។ ពួកវាមានកម្រិតស្និទ្ធស្នាលទាបជាងធម្មជាតិសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនម៉ាស៊ីនផ្ទៃខាងក្រោយ។ ការពិតនៃសារធាតុគីមីដាច់ដោយឡែកនេះអនុញ្ញាតឱ្យមានការបញ្ចេញសារធាតុពុលខ្ពស់នៅកំហាប់សារធាតុ reagent ទាបជាងយ៉ាងខ្លាំង។ ជាធម្មតាអ្នកត្រូវការប្រហែល 150 mM ដើម្បីបញ្ចេញគោលដៅដែលចង់បានទាំងស្រុង។ ការកាត់បន្ថយយ៉ាងសំខាន់នេះកាត់បន្ថយភាពតានតឹងជារួមលើរចនាសម្ព័ន្ធអង់ស៊ីមឆ្ងាញ់។
ដំណោះស្រាយប្រភេទទី 2៖ ការបញ្ជាក់ពីការពិតនៃការបន្សុត
ប្រូតេអ៊ីនដែលបានសម្តែងខ្ពស់ខ្លះបង្កើតជាអង្គធាតុបញ្ចូលមិនរលាយពីកំណើត។ ដំណើរការពួកវាប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព ទាមទារលក្ខខណ្ឌផ្ទុកយ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរបំផុត។ ការប្រើប្រាស់ 6M Guanidine-HCl ឬ 8M Urea ក្លាយជាចាំបាច់យ៉ាងតឹងរ៉ឹងដើម្បីរំលាយសារធាតុប្រមូលផ្តុំទាំងនេះ។
កំណត់សម្គាល់ការអនុវត្តសំខាន់៖ ម៉ូលេគុល elution បឋមមិនដើរតួជាអ្នកសម្អាត denaturant នៅក្នុងសេណារីយ៉ូស្មុគស្មាញទាំងនេះទេ។ Heavy denaturants ផ្លាស់ប្តូរជាមូលដ្ឋាននៃទម្រង់ចងរាងកាយទាំងមូល។ ប្រសិនបើអ្នកប្រើ Guanidine កំឡុងពេលបន្សុត អ្នកត្រូវតែលាងសំណាកគំរូទៅជា Urea មុនពេលដំណើរការ SDS-PAGE។ ជំហានចាំបាច់នេះការពារការគ្រីស្តាល់មហន្តរាយនៅពេលដែលលាយបញ្ចូលគ្នាជាមួយបណ្តុំផ្ទុកស្តង់ដារ។
ដំណោះស្រាយប្រភេទទី 3៖ ស្ថេរភាពសតិបណ្ដោះអាសន្ន
ស្មុគ្រស្មាញពហុរងមួយចំនួននៅតែងាយនឹងមានការបែកបាក់ភ្លាមៗ។ អ្នកគួរតែបំពេញបន្ថែមនូវសតិបណ្ដោះអាសន្ននៃការបន្សុតរួមគ្នាជាប្រចាំ ដើម្បីទប់ទល់នឹងកម្លាំងដែលរំខានក្នុងអំឡុងពេលដំណាក់កាលនៃការផ្លាស់ប្តូរដ៏សំខាន់។ ការបន្ថែមស្ថេរភាពដែលមិនមែនជាអ៊ីយ៉ុងដូចជា PEG ឬ glycerol ផ្តល់នូវការគាំទ្ររចនាសម្ព័ន្ធចាំបាច់។ សារធាតុបន្ថែមទាំងនេះការពារបំណះ hydrophobic និងរក្សាបាននូវភាពត្រឹមត្រូវនៃការអនុលោមតាមលក្ខណៈសកលពេញមួយការរត់។
យុទ្ធសាស្ត្រ |
អត្ថប្រយោជន៍បឋម |
ករណីប្រើប្រាស់ល្អបំផុត |
|---|---|---|
ជ័រ Cobalt |
បន្ថយកម្រិតពន្លឺ (~150 mM) |
គោលដៅរសើបងាយនឹងប្រមូលផ្តុំ |
ការបន្ថែមអ៊ុយ/ហ្គានីឌីន |
រំលាយអង្គធាតុបញ្ចូល |
កន្សោមប្រូតេអ៊ីនមិនរលាយ |
PEG / Glycerol Buffering |
ការពារការបែកបាក់ស្មុគស្មាញ |
ស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនពហុរង |
បញ្ហាអាជីវកម្ម
ការត្រួតពិនិត្យបទប្បញ្ញត្តិទាក់ទងនឹងសុវត្ថិភាពមន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅនៅតែបន្តកើនឡើងនៅទូទាំងពិភពលោក។ សារធាតុប្រតិកម្មគីមីបែបប្រពៃណីមានផ្ទុកការពុលដល់ប្រព័ន្ធបន្តពូជ និងហានិភ័យនៃការរំខានដល់ប្រព័ន្ធ endocrine ។ ជាងនេះទៅទៀត ការចំណាយខ្ពស់នៃការបរាជ័យនៅខាងក្រោមទឹកដោយសារតែការលេចធ្លាយលោហៈធ្ងន់បង្កបញ្ហាប្រឈមក្នុងប្រតិបត្តិការយ៉ាងសំខាន់។ អុកស៊ីតកម្មនីកែលជារឿយៗបំផ្លាញបេក្ខភាពប្រូតេអ៊ីនព្យាបាលដែលងាយរងគ្រោះក្នុងដំណាក់កាលអភិវឌ្ឍន៍នៅពេលក្រោយ។ គ្រឿងបរិក្ខារត្រូវការលំហូរការងារដែលមានសុវត្ថិភាពជាងមុន ដើម្បីការពារទាំងបុគ្គលិក និងការពិសោធន៍ដ៏មានតម្លៃ។
ប្រភេទដំណោះស្រាយ៖ ជ័រស៊ីលីកា និងលីស៊ីនជំនាន់ក្រោយ
លក្ខណៈវិនិច្ឆ័យវាយតម្លៃ៖ ការជំនួសម៉ាទ្រីស Ni-NTA ហួសសម័យ លុបបំបាត់គ្រោះថ្នាក់ពុលជាច្រើនក្នុងពេលដំណាលគ្នា។ ម៉ាទ្រីសដែលមានមូលដ្ឋានលើស៊ីលីកាជំនាន់ក្រោយប្រើប្រាស់យន្តការបន្សុត Lysine ជាក់លាក់ខ្ពស់។ ការផ្លាស់ប្តូរទំនើបនេះដកចេញនូវតម្រូវការដ៏តឹងរឹងសម្រាប់សារធាតុដែលអាចឆេះបានដូចជាអេតាណុលក្នុងអំឡុងពេលផ្ទុករយៈពេលវែង។ អ្នកសម្រេចបាននូវបរិយាកាសមន្ទីរពិសោធន៍ដែលមានសុវត្ថិភាព និងអនុលោមជាងមុនគួរឱ្យកត់សម្គាល់ភ្លាមៗ។
លក្ខណៈពិសេសទៅលទ្ធផល៖ Lysine ធ្វើអន្តរកម្មជាមួយគោលដៅតាមរយៈការភ្ជាប់អ៊ីដ្រូសែនកម្រិតស្រាល និងអន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្តាតទន់ភ្លន់។ វាផ្តល់នូវភាពឆបគ្នានៃជីវគីមីដ៏អស្ចារ្យដែលមិនអាចប្រៀបផ្ទឹមបាន។ វាអនុញ្ញាតឱ្យគោលដៅដើម្បីនិយាយយ៉ាងស្អាតដោយមិនពឹងផ្អែកលើភ្នាក់ងារផ្លាស់ទីលំនៅដ៏ឈ្លានពាន។ អ្នកជៀសវាងទាំងស្រុងនូវហានិភ័យនៃការរិចរិលរចនាសម្ព័ន្ធដែលទាក់ទងនឹងវិធីសាស្ត្រផ្លាស់ទីលំនៅបែបប្រពៃណី។ ដំណើរការដកចេញដែលប្រើពេលយូរ និងធុញទ្រាន់ក្លាយជាលែងប្រើប្រាស់ទាំងស្រុង។
តក្កវិជ្ជាបញ្ជីសម្រាំង
គ្រឿងបរិក្ខារដែលផ្តល់អាទិភាពដល់ជីវវិទ្យារចនាសម្ព័ន្ធស្មុគ្រស្មាញ ឬការវាយតម្លៃប្រូតេអ៊ីនព្យាបាលប្រឈមមុខនឹងការទាមទារពិសោធន៍ដ៏តឹងរ៉ឹង។ ការអនុលោមតាមច្បាប់សុខភាព និងសុវត្ថិភាពបរិស្ថានយ៉ាងម៉ត់ចត់ (EHS) នៅតែជាកត្តាសំខាន់បំផុតសម្រាប់ការអនុម័តពីស្ថាប័ន។ ក្រុមគួរតែគណនាយ៉ាងត្រឹមត្រូវនូវ ROI នៃការផ្លាស់ប្តូរទៅស្លាកកម្មសិទ្ធិជំនួសទាំងស្រុង។ ការធ្វើស្តង់ដារនូវជំហានសម្អាត IMAC បែបប្រពៃណីតម្រូវឱ្យមានកម្លាំងពលកម្មដែលពឹងផ្អែកខ្លាំង និងប្រើប្រាស់បរិមាណដ៏ច្រើននៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន។ ការជៀសវាង imidazole ជាទូទៅជួយសម្រួលដល់បំពង់ផលិតកម្មទាំងមូល។ វាធានាបាននូវលទ្ធភាពជោគជ័យអតិបរមាសម្រាប់ការវាយតម្លៃខាងក្រោមដែលមានលក្ខណៈរសើបខ្លាំង។
យើងបានគ្របដណ្ដប់យ៉ាងទូលំទូលាយនូវភាពពិតនៃសារធាតុគីមីដែលមិនច្បាស់លាស់នៃអស្ថិរភាពនៃប្រូតេអ៊ីនដែលបណ្ដាលមកពីសតិបណ្ដោះអាសន្ន។ ខណៈពេលដែលវាមិនដើរតួជា denatural denaturant ការប្រើប្រាស់មិនត្រឹមត្រូវអាចបំផ្លាញភាពសុចរិតរបស់ប្រូតេអ៊ីនយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។ កំហាប់ការងារច្រើនពេក កំដៅគំរូមិនត្រឹមត្រូវ ឬការធ្វេសប្រហែសក្នុងការវិភាគទូទៅបំផ្លាញទិន្នន័យពិសោធន៍ថ្លៃៗ។
ពិចារណាជំហានបន្ទាប់ដែលតម្រង់ទិសសកម្មភាពសង្ខេបទាំងនេះសម្រាប់មន្ទីរពិសោធន៍របស់អ្នក៖
ធ្វើសវនកម្មលើពិធីការបន្សុតបច្ចុប្បន្នរបស់អ្នកភ្លាមៗសម្រាប់ជំហាននៃការផ្តោតអារម្មណ៍ខ្ពស់ដែលមិនចាំបាច់។
ជំនួសវិធីស្ងោរស្ដង់ដារដោយជំហានកំដៅ 70°C ទន់ភ្លន់មុននឹងការប្រើជែល electrophoresis។
ផ្លាស់ប្តូរលំហូរការងារបរិមាណអុបទិកខាងក្រោមទាំងអស់យ៉ាងតឹងរ៉ឹងទៅការវាយតម្លៃរបស់ Bradford ។
វាយតម្លៃវេទិកាម៉ាទ្រីសដែលមានកំហាប់ទាប ឬឥតគិតថ្លៃទាំងស្រុងសម្រាប់កម្មវិធីខាងក្រោមដែលមានភាពរសើបខ្លាំង។
ចម្លើយ៖ បាទ។ កំដៅទ្រនាប់ដែលមានផ្ទុកសារធាតុ imidazole ដល់ 100 ° C សម្រាប់ SDS-PAGE ធ្វើឱ្យអ៊ីដ្រូសែនចំណងអាស៊ីត-labile ។ កំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 70 អង្សាសេរយៈពេល 5 នាទីគឺជាជម្រើសសុវត្ថិភាពដែលត្រូវបានណែនាំ។
A: Imidazole ស្រូបយ៉ាងខ្លាំងនៅ 280 nm ។ កំហាប់ elution ធម្មតា (ឧ, 250 mM) អាចណែនាំការស្រូបយកផ្ទៃខាងក្រោយសិប្បនិម្មិតពី 0.2 ទៅ 0.4 ដែលបណ្តាលឱ្យមានការអានខ្ពស់មិនពិត។
A: ខណៈពេលដែលការ elution ស្ដង់ដារប្រើ 50-250 mM ការប្រមូលផ្តុំទៅជិត 1M ដើរតួដូចជាអំបិលខ្ពស់ ហើយអាចរំខានដល់អន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន និងប្រូតេអ៊ីន និងបណ្តាលឱ្យមានការប្រមូលផ្តុំ។
ចម្លើយ៖ សម្រាប់ស្ថេរភាពរយៈពេលវែង ការវិភាគអង់ស៊ីម ឬនៅក្នុងការសិក្សា vivo, imidazole គួរតែត្រូវបានយកចេញតាមរយៈ desalting columns ឬ dialysis ព្រោះការប៉ះពាល់យូរអាចនាំអោយមានភ្លៀងធ្លាក់ និងការរសាត់តាមរចនាសម្ព័ន្ធ។
