Imidazole Denature Protein ရှိလား။

Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) သည် ကမ္ဘာတစ်ဝှမ်းတွင် သူ၏ tagged ပရိုတင်းများကို သန့်စင်ရန်အတွက် စံတစ်ခုအဖြစ် ကျန်ရှိနေပါသည်။ သို့သော် သုတေသီများသည် ပုံမှန်ဓာတ်ခွဲခန်းလုပ်ထုံးလုပ်နည်းများအတွင်း စိတ်ရှုပ်စရာအကျပ်အတည်းကို မကြာခဏရင်ဆိုင်ရလေ့ရှိသည်။ ၎င်းတို့သည် မမျှော်လင့်ထားသော ရေစုန်စုစု၊ အင်ဇိုင်းလုပ်ငန်းဆောင်တာ ရုတ်တရက် ဆုံးရှုံးသွားခြင်းနှင့် မလိုလားအပ်သော ရှုပ်ထွေးသော ပေါင်းစည်းခြင်းကို သတိပြုမိကြသည်။ သင်၏ ဂရုတစိုက် ဖော်ပြထားသော ပစ်မှတ်ကို တက်ကြွစွာ ဖျက်စီးခြင်း ၊ အဖြစ်မှန်သည် အလွန်သိမ်မွေ့သော နားလည်မှု လိုအပ်သည်။ ဓာတု imidazole သည် ယူရီးယား သို့မဟုတ် ဂွာနီဒင်းကဲ့သို့ ရှေးရိုးစွဲဆေးမဟုတ်ပေ။ သို့သော်၊ ၎င်းသည် သီးခြားစမ်းသပ်မှုအခြေအနေများအောက်တွင် နူးညံ့သိမ်မွေ့သောပရိုတင်းဖွဲ့စည်းပုံများကို အလွယ်တကူမတည်မငြိမ်ဖြစ်စေသည်။ ပြင်းထန်သော ပြင်းအားများ၊ အပူဖိစီးမှု သို့မဟုတ် ကြာရှည်စွာ ထိတွေ့မှုသည် အရေးကြီးသော ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုကို ပုံမှန် အနှောင့်အယှက်ပေးသည်။ သင့်ဓာတ်ခွဲခန်းအတွက် ရှင်းလင်းပြတ်သားသော သက်သေအခြေခံမူဘောင်ကို ပံ့ပိုးပေးရန် ဤဆောင်းပါးကို ကျွန်ုပ်တို့ ရေးဆွဲထားပါသည်။ buffer-induced structural damage ကို တိကျစွာသိရှိနိုင်ပုံကို သင်လေ့လာနိုင်မည်ဖြစ်ပါသည်။ သင်၏ သန့်စင်မှုကြားခံများကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင် မည်သို့ပြုလုပ်ရမည်ကို အတိအကျပြသပါမည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ ထိခိုက်လွယ်သော ရေအောက်ပိုင်းစစ်ဆေးမှုများကို ကာကွယ်ရန် ပိုမိုဘေးကင်းသော အခြားပလပ်ဖောင်းများကို အကဲဖြတ်ပါမည်။

သော့ထုတ်ယူမှုများ

• အာရုံစူးစိုက်မှု ကန့်သတ်ချက်များ- Standard elution concentrations (50–250 mM) သည် ယေဘုယျအားဖြင့် ဘေးကင်းသော်လည်း ပြင်းထန်သောပြင်းအား (~1M) သည် အားသွင်းမှု-ဖျန်ဖြေပေးထားသော ပရိုတိန်းဓာတ် အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေသည့် ပြင်းထန်သောဆားနှင့်တူသောအကျိုးသက်ရောက်မှုများရှိသည်။

• အပူပိုင်းပျက်စီးခြင်းအန္တရာယ်- SDS-PAGE အတွက် imidazole ပါ၀င်သော ပရိုတင်းနမူနာများကို ပြုတ်ခြင်းဖြင့် အက်ဆစ်-labile bond hydrolysis ကိုဖြစ်စေပြီး ပစ်မှတ်ကို ပျက်စီးစေပါသည်။

• ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု နှောင့်ယှက်မှု- Imidazole သည် 280 nm တွင် ခရမ်းလွန်ရောင်ခြည်ကို ပြင်းပြင်းထန်ထန် စုပ်ယူသည် (မှားယွင်းသော အထွက်နှုန်းဒေတာကို ဖြစ်စေသည်) နှင့် ကြေးနီအခြေခံ စစ်ဆေးမှုများ (Lowry၊ Biuret) ကို အနှောင့်အယှက်ပေးသည်။

• လုပ်ငန်းစဉ်အခြားရွေးချယ်စရာများ- ကိုဘော့အခြေခံ resins သို့ကူးပြောင်းခြင်းသည် လိုအပ်သော imidazole အာရုံစူးစိုက်မှုကို လျော့နည်းစေပြီး အသစ်သော Silica/Lysine matrices များသည် imidazole အတွက် လိုအပ်မှုကို လုံးလုံးလျားလျား ဖယ်ရှားပေးပါသည်။

Imidazole-Induced Protein မတည်ငြိမ်မှု၏ ယန္တရားများ

ဓာတ်ခွဲခန်းအဖွဲ့များသည် သဘာဝပစ်မှတ်မတည်မငြိမ်ဖြစ်မှုနှင့် ကြားခံကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော denaturation တို့ကို ခွဲခြားရန် မကြာခဏ ရုန်းကန်နေရပါသည်။ ဤတိကျသောပြဿနာကို မှားယွင်းစွာရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းသည် အထိန်းအကွပ်ဆိုင်ရာ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ အချက်အလက်ကို ထိခိုက်စေသည်။ ၎င်းသည် ကျယ်ပြန့်ပြီး အချိန်ကုန်သော စမ်းသပ်မှု ပြန်လည်လုပ်ဆောင်မှုများလည်း လိုအပ်ပါသည်။ သင့်ပရိုတင်းအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိစေမည့် ကြားခံများကို အတိအကျနားလည်ခြင်းသည် ဤအဓိကလုပ်ငန်းဆောင်တာများကို တားဆီးပေးပါသည်။

ပြုပြင်မထားသော စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်များသည် ပင်ကိုယ်အားဖြင့် အယ်ကာလိုင်းအလွန်များသည်။ titrate elution buffers များကို မှန်ကန်စွာ မလုပ်ဆောင်ပါက ကော်လံအပလီကေးရှင်းပေါ်တွင် ရုတ်တရက်၊ လျင်မြန်သော pH မြင့်တက်စေသည်။ ဤပြင်းထန်သောအပြောင်းအရွှေ့သည် တတိယတန်းဖွဲ့စည်းပုံအတွင်း ဒေသအလိုက် ပြန့်ပွားမှုကို အစပျိုးစေသည်။ နူးညံ့သိမ်မွေ့သော ပရိုတင်း ရှုပ်ထွေးမှုများသည် ထိုကဲ့သို့ ကြမ်းတမ်းသော ပတ်ဝန်းကျင်များတွင် လျင်မြန်စွာ ကွဲကွာသွားပါသည်။ elution အဆင့်ကိုမစတင်မီ သင်၏ကြားခံ pH ကို အမြဲဂရုတစိုက်စစ်ဆေးပါ။

အလွန်အကျွံပါဝင်မှုသည် နမူနာသမာဓိအတွက် နောက်ထပ်အန္တရာယ်များသော လျှို့ဝှက်ခြိမ်းခြောက်မှုကို မိတ်ဆက်ပေးသည်။ အံသွားအဆင့်များသည် 1M အနီးသို့ ချဉ်းကပ်လာသည်နှင့်အမျှ၊ ဖြေရှင်းချက်သည် အိုင်ယွန်အားပြင်းသော အိုင်ယွန်-အားပြင်းသော အရည်အဖြစ် လုံးလုံးလျားလျား လုပ်ဆောင်သည်။ ဤအသံထွက် 'ဆားမြင့်မားခြင်း' အကျိုးသက်ရောက်မှုသည် အားနည်းသော လျှပ်စစ်စတီကျိတ် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို တိုက်ရိုက်နှောင့်ယှက်သည်။ မွေးရပ်မြေပုံစံများကို ထိန်းသိမ်းရန် လိုအပ်သော ဝင်ရိုးစွန်းချည်နှောင်မှုများ လုံးဝပြိုကွဲသွားသည်။ ၎င်းသည် ပရိုတင်းမော်လီကျူးများ ပတ်ပတ်လည်ရှိ ရေဓါတ်ခွံကို ပြောင်းလဲစေသည်။ ထို့ကြောင့်၊ အရေးကြီးသော ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်မှုများ (PPIs) သည် multimeric complexes များကို အတူတကွ မထိန်းထားနိုင်ပါ။

နောက်ဆုံးတွင်၊ တိုးချဲ့ပေါက်ဖွားပြီးနောက် elution သည် နှေးကွေးသောပုံစံဖြင့် ပျံ့လွင့်မှုကို အားပေးသည်။ ပစ်မှတ်ပရိုတိန်းများသည် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ အဖြေမထွက်နိုင်ပါ။ နောက်ဆက်တွဲ dialysis သို့မဟုတ် ရေရှည်သိုလှောင်မှု အဆင့်များအတွင်း လေးလံသော အစုလိုက်အပြုံလိုက် ဖြစ်ပေါ်နေသည်ကို သတိပြုမိပေမည်။ သင်၏ ထင်ရှားသောအပိုင်းအစများကို လုပ်ဆောင်ခြင်းသည် ဤအန္တရာယ်ရှိသော ထိတွေ့မှုဝင်းဒိုးကို ချက်ချင်းကန့်သတ်သည်။ Prompt desating သည် သင့်ပရိုတိန်းများသည် ၎င်းတို့၏ ရည်ရွယ်လုပ်ဆောင်သော မူလအခြေအနေအား ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားကြောင်း သေချာစေသည်။

Imidazole Denaturation ကိုဖြစ်စေသော ဘုံပရိုတိုကော အမှား 3 ခု

ပရိုတိုကော သွေဖည်မှုများသည် အခြားနည်းဖြင့် ပြီးပြည့်စုံသော သန့်စင်မှုများကို မကြာခဏ ပျက်စီးစေသည်။ မလိုလားအပ်သော အသွင်ပြောင်းခြင်းကို ဖြစ်စေသည့် အဓိက လုပ်ထုံးလုပ်နည်း အမှားသုံးခုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဤအမှားများကို ရှောင်ကြဉ်ခြင်းသည် သင်၏ စမ်းသပ်မှုဆိုင်ရာ ညီညွတ်မှုကို သိသိသာသာ တိုးတက်စေသည်။

1. အမှား 1- SDS-PAGE အတွက် ပွက်ပွက်ဆူနေသော နမူနာများ။
   အန္တရာယ်- သုတေသီများသည် ဂျယ်မထုတ်မီ 100°C တွင် နမူနာများကို ပုံမှန်ပြုတ်ကြသည်။ မြင့်မားသော elution ပြင်းအားများပါဝင်သော ဆူနေသောနမူနာများသည် နူးညံ့သိမ်မွေ့သော အက်ဆစ်-labile နှောင်ကြိုးများကို ခွာစေသည်။ မြင့်မားသော ဓါတ်ပစ္စည်းများပါဝင်မှုသည် ဤပျက်စီးစေသော hydrolysis ကို သိသိသာသာ အရှိန်မြှင့်ပေးသည်။ သင့်တွင် ထွက်ပေါ်လာသော gels များပေါ်တွင် မြင်သာထင်သာရှိသော တီးဝိုင်းများ ပျက်စီးခြင်းနှင့် လိမ်းကျံခြင်းကို မလွဲမသွေ မြင်တွေ့ရမည်ဖြစ်သည်။
   ပြုပြင်နည်း- သင့်နမူနာများကို 70°C တွင် အစား 5 မိနစ်တိတိ ဖုတ်ပါ။ ဤနူးညံ့သိမ်မွေ့သော အပူပေးနည်းလမ်းသည် ဓာတုပျက်စီးခြင်းမရှိဘဲ electrophoresis အတွက် ပရိုတင်းများကို ဘေးကင်းစွာ တွန်းလှန်ပေးသည်။ သင်၏အမှန်တကယ်အထွက်နှုန်းကိုကိုယ်စားပြုသော ရှင်းလင်းတိကျသော တီးဝိုင်းများကို သင်ရရှိနိုင်ပါသည်။

2. အမှား 2- ညစ်ညမ်းမှုပြဿနာများကိုဖြေရှင်းရန် Imidazole အာရုံစူးစိုက်မှုကို အားကိုးခြင်း။
   အန္တရာယ်- အော်ပရေတာများသည် တစ်ခါတစ်ရံ မလိုအပ်ဘဲ 500 mM ထက်ကျော်လွန်၍ elution buffers များကို တွန်းပို့ကြသည်။ သူတို့သည် စည်းနှောင်မှုကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်လုပ်မည့်အစား ခေါင်းမာသောပစ်မှတ်များကို ကော်လံမှ အတင်းတွန်းပို့ရန် ကြိုးစားကြသည်။ ဤလေးလံသောလက်ဖြင့်ချဉ်းကပ်မှုသည် metalloproteins မှသတ္တုအိုင်းယွန်းကိုတည်ငြိမ်စေသောဖယ်ထုတ်ပြီးအလုပ်မလုပ်သော apoproteins ကိုဖန်တီးသည်။ ၎င်းသည် downstream in-vivo စစ်ဆေးမှုတိုင်းအတွက် ဆဲလ်အဆိပ်သင့်မှုအန္တရာယ်ကိုလည်း မြင့်မားစေသည်။
   ပြုပြင်မှု- elution strength တိုးလာမည့်အစား သင်၏ ပဏာမ လက်ဆေးသည့် အဆင့်များကို မြှင့်တင်ပါ။ ကော်လံထုထည် (CV) ကို အမှန်တကယ် ပရိုတင်းဝန်နှင့် အတိအကျ ကိုက်ညီမှုမရှိသော စည်းနှောင်မှုတွင် အတိအကျမဟုတ်သော စည်းနှောင်မှုကို ဖြေရှင်းပါ။ 200-500 mM Arginine သည် အညစ်အကြေးများကို လျှပ်စစ်ဓာတ်အား ပြတ်တောက်မှုဖြစ်စေသည်။ တနည်းအားဖြင့် 1-4 mM ATP ဖြင့် ဆေးကြောခြင်းသည် သင့်ပစ်မှတ်မှ တွဲဖက်သန့်စင်ထားသော မော်လီကျူးများကို အောင်မြင်စွာ ထုတ်လွှတ်သည်။

3. အမှား 3- Histidine Protonation States ကို လျစ်လျူရှုခြင်း။
   အန္တရာယ်- Buffer pH သည် ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ ပေါင်းစပ်စက်ရုပ်များကို လုံးဝထိန်းချုပ်သည်။ ချည်နှောင်ခြင်း သို့မဟုတ် ဆေးကြောစဉ်အတွင်း pH နိမ့်လွန်းခြင်းသည် အရေးကြီးသော Histidine deprotonation ကို ကာကွယ်ပေးသည်။ isoelectric point သို့ချဉ်းကပ်ခြင်းသည် အချိန်မတန်မီ ပစ်မှတ်ကို ဖယ်ထုတ်ခြင်းဆီသို့ ဦးတည်စေသည်။ ပရိုတိန်းများသည် အစေးတွင်ပါဝင်မှုအလွန်နည်းသော၊ တစ်ခါတစ်ရံတွင် 10 mM မျှသာရှိနိုင်သည်။ ၎င်းသည် အော်ပရေတာများအား ၎င်းတို့၏ ထွက်နှုန်းကို ဖမ်းယူရန် စံပရိုတိုကောများကို အန္တရာယ်ရှိစွာ ပြောင်းလဲရန် တွန်းအားပေးသည်။ သင့်လျော်သော အားသွင်းမှုအခြေအနေများကို ထိန်းသိမ်းရန် သင်၏ကြားခံ pH သည် 7.5 သို့မဟုတ် အထက်တွင် ရှိနေကြောင်း သေချာစေရမည်။

ရေအောက်သက်ရောက်မှု- Imidazole Skews Protein အကဲဖြတ်ခြင်း။

ကျန်ရှိသောကြားခံအစိတ်အပိုင်းများသည် ရေအောက်ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာမှုအကဲဖြတ်ချက်များကို လွဲချော်သွားအောင် အကဲဖြတ်ရပါမည်။ မမှန်ကန်သော တိုင်းတာမှုများသည် နောက်ဆက်တွဲ စမ်းသပ်မှု အဆင့်များကို ပျက်စီးစေပြီး အဖိုးတန် ဓာတ်ခွဲခန်း အရင်းအမြစ်များကို ဖြုန်းတီးပါသည်။

အကဲဖြတ်ခြင်း အတိုင်းအတာ- အရေအတွက် တိကျမှု

ဓာတ်ပစ္စည်းများသည် ပြင်းထန်သော ပင်ကိုယ် UV စုပ်ယူမှု လက္ခဏာများကို ပြသသည်။ ပုံမှန် 250 mM elution ကြားခံတစ်ခုသည် နောက်ခံ $A_{280}$ မှ 0.2 မှ 0.4 အထိ ထုတ်ပေးသည်။ ဤရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာဖြစ်စဉ်သည် ပစ်မှတ်အထွက်နှုန်းတွက်ချက်မှုများကို သိသိသာသာ တိုးမြင့်စေသည်။ သင်ဟာ ပြွန်ထဲမှာ အမှန်တကယ်ရှိနေတဲ့ ပရိုတင်းဓာတ်ထက် အများကြီး ပိုထုတ်တယ်လို့ ထင်ကောင်းထင်နိုင်ပါတယ်။

အမှားပြင်ခြင်းနည်းဗျူဟာ- သင်၏ spectrophotometer ကို အမြဲတမ်း စေ့စေ့စပ်စပ် ကွက်လပ်ထားပါ။ သင်၏ရည်ညွှန်းအလွတ်အဖြစ် elution buffer ၏ အတိအကျဖွဲ့စည်းမှုကို သင်အသုံးပြုရပါမည်။ တနည်းအားဖြင့် သင်၏အလုပ်အသွားအလာကို Bradford စစ်ဆေးမှုတစ်ခုသို့ ကူးပြောင်းပါ။ ဤယုံကြည်စိတ်ချရသော Coomassie-based နည်းလမ်းသည် ထိုကဲ့သို့သော သီးခြား optical စွက်ဖက်မှုကို ထိရောက်စွာ ခုခံနိုင်သည် ။ Lowry နှင့် Biuret assays ကဲ့သို့သော ကြေးနီလျော့ချနည်းများကို လုံးဝရှောင်ကြဉ်သင့်သည်။ ဓာတုဗေဒသည် ကြေးနီအိုင်းယွန်းများကို ပင်ကိုယ်အားဖြင့် လျော့နည်းစေပြီး ပမာဏကြီးမားသော ချို့ယွင်းမှုများကို ဖြစ်စေသည်။

အကဲဖြတ်ခြင်း အတိုင်းအတာ- ဖွဲ့စည်းပုံနှင့် လုပ်ဆောင်မှုဆိုင်ရာ ဆန်းစစ်ချက်များ

ကျန်ရှိသော မော်လီကျူးများသည် ရှုပ်ထွေးသော metalloenzymes များအတွင်းတွေ့ရှိရသော သတ္တုချည်နှောင်သည့်နေရာများအတွက် ပြင်းထန်စွာ ယှဉ်ပြိုင်ကြသည်။ ထို့အပြင်၊ ၎င်းတို့သည် ထိလွယ်ရှလွယ် ဆဲလ်အခြေခံ သို့မဟုတ် in-vivo ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ စစ်ဆေးမှုများတွင် ပြင်းထန်သော endocrine အနှောင့်အယှက်များအဖြစ် လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။ သင့်နမူနာတွင် ပျံ့နှံ့နေသော ၎င်းတို့ကို ချန်ထားခဲ့ခြင်းသည် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ ဆက်စပ်မှုနှင့် ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ အချက်အလက် ခိုင်မာမှုကို တိုက်ရိုက်ထိခိုက်စေသည်။

ဖယ်ရှားရေး ပရိုတိုကောများ- ရေအောက်ပိုင်း ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို အကဲဖြတ်သည့်အခါ၊ အကြွင်းအကျန်များကို ချက်ချင်းဖယ်ရှားရန် လုပ်ပိုင်ခွင့်ပေးသည်။ လျင်မြန်သော အလှည့်အပြောင်းအချိန်များအတွက် လျင်မြန်သောအရွယ်အစား-ချန်လှပ်ထားသော ကော်လံများကို အသုံးပြုပါ။ Centrifugal ultrafiltration နှင့် overnight dialysis သည် အင်ဇိုင်းမစမ်းသပ်မီ စေ့စေ့စပ်စပ်နမူနာရှင်းလင်းမှုအတွက် အထူးကောင်းမွန်ပါသည်။

Assay အမျိုးအစား	အနှောင့်အယှက်အဆင့်	စွက်ဖက်မှု ယန္တရား	ထောက်ခံချက်
A280 (UV Absorbance)	မြင့်သည်။	280 nm တွင် ပြင်းထန်သော ပင်ကိုယ်စုပ်ယူမှု	ဂရုတစိုက် ဗလာ သို့မဟုတ် ရှောင်ပါ။
ဘရက်ဖို့ဒ် (Coomassie)	နိမ့်သည်။	ဆိုးဆေးချည်နှောင်ခြင်းနှင့် အပြန်အလှန်သက်ရောက်မှုအနည်းဆုံး	အလွန်အကြံပြုထားသည်။
Lowry / Biuret	ပြင်းထန်သည်။	ကြေးနီကို လျော့နည်းစေပြီး အရောင်ပြောင်းခြင်းကို ကာကွယ်ပေးသည်။	မသုံးပါနဲ့။

လုပ်ငန်းစဉ် ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ခြင်း- Imidazole ထိတွေ့မှုကို စွန့်ထုတ်ခြင်းမရှိဘဲ အထွက်နှုန်းကို လျှော့ချခြင်း။

ထိတွေ့မှုကို လျှော့ချခြင်းသည် သင်၏ နောက်ဆုံးလုပ်ငန်းဆောင်တာ အထွက်နှုန်းကို ထိရောက်စွာ ကာကွယ်ပေးပါသည်။ အလွန်ပစ်မှတ်ထားသော၊ သက်သေပြထားသော နည်းဗျူဟာများစွာကို အသုံးပြု၍ ဓာတ်ခွဲခန်းလုပ်ငန်းစဉ်များကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင် လုပ်ဆောင်နိုင်သည်။

ဖြေရှင်းချက်အမျိုးအစား 1- ကိုဘော့အခြေခံ IMAC စနစ်များသို့ ပြောင်းခြင်း။

Cobalt resins သည် စံ Ni-NTA matrices များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပစ်မှတ်တိကျမှု ပိုမိုမြင့်မားသည်။ ၎င်းတို့သည် နောက်ခံအိမ်ရှင်ပရိုတိန်းများအတွက် သဘာဝအတိုင်း ဆက်စပ်မှုနည်းပါးသော အဆင့်သတ်မှတ်ချက်များရှိသည်။ ဤထူးခြားသောဓာတုဓာတ်မှန်သည် အလွန်သန့်စင်သော elution ကို သိသိသာသာ သက်သာသော ဓါတ်ပြုမှုပါဝင်မှုတွင် ခွင့်ပြုသည်။ သင်အလိုရှိသောပစ်မှတ်ကို အပြီးအပိုင်ထုတ်ရန် 150 mM ဝန်းကျင်သာ လိုအပ်ပါသည်။ ဤသိသိသာသာ လျှော့ချခြင်းသည် နူးညံ့သိမ်မွေ့သော အင်ဇိုင်းဖွဲ့စည်းပုံများပေါ်တွင် သက်ရောက်သော ဖိအားအားလုံးကို လျှော့ချပေးသည်။

ဖြေရှင်းချက် အမျိုးအစား 2- သန့်စင်မှု အစစ်အမှန်များကို ထင်ရှားစေခြင်း။

အချို့သော အလွန်ဖော်ပြသော ပရိုတိန်းများသည် မူလအတိုင်း မပျော်ဝင်နိုင်သော ပါဝင်မှုကိုယ်ထည်များဖြစ်သည်။ ၎င်းတို့ကို ထိထိရောက်ရောက် စီမံဆောင်ရွက်ပေးခြင်းသည် အလွန်ပြင်းထန်သော အရှိန်အဟုန်မြှင့်သည့် အခြေအနေများ လိုအပ်ပါသည်။ 6M Guanidine-HCl သို့မဟုတ် 8M Urea ကိုအသုံးပြုခြင်းသည် ဤအစုအဝေးများကိုပျော်ဝင်ရန်အတွက် တင်းကြပ်စွာလိုအပ်ပါသည်။

အရေးကြီးသော အကောင်အထည်ဖော်မှုမှတ်စု- အဓိက elution မော်လီကျူးသည် ဤရှုပ်ထွေးသောအခြေအနေများတွင် denaturant cleaner အဖြစ်လုပ်ဆောင်ခြင်းမရှိပါ။ လေးလံသော denaturants များသည် ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ စည်းနှောင်မှု ပရိုဖိုင်တစ်ခုလုံးကို အခြေခံကျကျ ပြောင်းလဲစေသည်။ အကယ်၍ သင်သည် သန့်စင်နေစဉ်တွင် Guanidine ကိုအသုံးပြုပါက၊ SDS-PAGE ကိုမလုပ်ဆောင်မီ နမူနာကို ယူရီးယားသို့ dialyse လုပ်ရပါမည်။ ဤမဖြစ်မနေအဆင့်သည် စံတင်နေသည့်ကြားခံများနှင့် ရောနှောသောအခါ ကပ်ဆိုးပုံဆောင်ခဲဖြစ်ခြင်းကို တားဆီးပေးသည်။

ဖြေရှင်းချက်အမျိုးအစား 3- Buffer Stabilizers

အချို့သော subunit များစွာသော ရှုပ်ထွေးမှုများသည် ရုတ်ချည်း ကွဲထွက်ရန် အလားအလာ အလွန်များပါသည်။ ပြင်းထန်သော elution အဆင့်အတွင်း အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေသော အင်အားစုများကို တန်ပြန်ရန်အတွက် ပူးတွဲသန့်စင်သည့်ကြားခံများကို ပုံမှန်ဖြည့်စွက်သင့်သည်။ PEG သို့မဟုတ် glycerol ကဲ့သို့သော အိုင်းယွန်းမဟုတ်သော တည်ငြိမ်မှုကို ထည့်သွင်းခြင်းသည် လိုအပ်သော ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ပံ့ပိုးမှုကို ပေးသည်။ အဆိုပါ ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများသည် ရေအားလျှပ်စစ် ဖာထေးမှုများကို ကာ ကွယ်ကာ ပြေးလမ်းတစ်လျှောက်လုံး ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ ပုံစံတူ ခိုင်မာမှုကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။

ဗျူဟာ	အဓိကအကျိုးခံစားခွင့်	အကောင်းဆုံးအသုံးပြုမှု Case
ကိုဘော့အစေး	elution အဆင့်ကို လျှော့ချသည် (~150 mM)	ထိလွယ်ရှလွယ် ပစ်မှတ်များ စုစည်းမှု ဖြစ်နိုင်သည်။
ယူရီးယား/Guanidine ထပ်တိုးခြင်း။	ပါဝင်နေသော ခန္ဓာကိုယ်များကို ပျော်ဝင်စေသည်။	မပျော်ဝင်နိုင်သော ပရိုတိန်းအသုံးအနှုန်း
PEG/Glycerol Buffering	ရှုပ်ထွေးသော ပေါင်းစည်းခြင်းကို တားဆီးပေးသည်။	Multi-subunit ပရိုတိန်းရှုပ်ထွေးမှုများ

Imidazole-Free Purification Alternatives များကို အကဲဖြတ်ခြင်း။

စီးပွားရေးပြဿနာ

ယေဘူယျဓာတ်ခွဲခန်းဘေးကင်းရေးဆိုင်ရာ စည်းမျဉ်းစည်းကမ်း စစ်ဆေးမှုသည် ကမ္ဘာတစ်ဝှမ်းတွင် ဆက်လက်တိုးလာနေပါသည်။ ရိုးရာဓာတုဓာတ်ပစ္စည်းများသည် မျိုးပွားမှုအဆိပ်သင့်မှုနှင့် endocrine အနှောင့်အယှက်အန္တရာယ်များကို မှတ်တမ်းတင်ထားသည်။ ထို့အပြင်၊ လေးလံသောသတ္တု ယိုစိမ့်မှုကြောင့် ရေအောက်ပိုင်းတွင် ချို့ယွင်းမှု ကုန်ကျစရိတ် မြင့်မားခြင်းသည် ကြီးမားသော လုပ်ငန်းဆောင်ရွက်မှု စိန်ခေါ်မှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ နီကယ်ဓာတ်တိုးခြင်းသည် နောက်ပိုင်းတွင် ဖွံ့ဖြိုးမှုအဆင့်များအတွင်း ထိခိုက်လွယ်သော ကုထုံးပရိုတင်းများကို မကြာခဏ ဖျက်ဆီးသည်။ ဝန်ထမ်းများနှင့် အဖိုးတန်သော စမ်းသပ်မှုများ နှစ်ခုလုံးကို ကာကွယ်ရန် Facilities များသည် ပိုမိုဘေးကင်းသော အလုပ်အသွားအလာများ လိုအပ်ပါသည်။

ဖြေရှင်းချက်အမျိုးအစား- မျိုးဆက်သစ် ဆီလီကာနှင့် လိုင်စင်အစေးများ

အကဲဖြတ်ခြင်း စံသတ်မှတ်ချက်- ခေတ်မမီတော့သော Ni-NTA မက်ထရစ်များကို အစားထိုးခြင်းသည် အဆိပ်အတောက်အန္တရာယ်များစွာကို တစ်ပြိုင်နက် ဖယ်ရှားပေးပါသည်။ မျိုးဆက်သစ် စီလီကာအခြေခံမက်ထရစ်များသည် အလွန်တိကျသော Lysine-mediated သန့်စင်ရေးစက်များကို အသုံးပြုသည်။ ဤခေတ်သစ်အကူးအပြောင်းသည် ရေရှည်သိုလှောင်မှုအတွင်း အီသနောကဲ့သို့ မီးလောင်လွယ်သော ဓာတ်ပစ္စည်းများအတွက် တင်းကျပ်သောလိုအပ်ချက်ကို ဖယ်ရှားပေးပါသည်။ သင်သည် သိသိသာသာ ဘေးကင်းပြီး ပိုမိုလိုက်လျောညီထွေရှိသော ဓာတ်ခွဲခန်းပတ်ဝန်းကျင်ကို ချက်ချင်းရရှိမည်ဖြစ်သည်။

အင်္ဂါရပ်များမှ ရလဒ်များ- Lysine သည် အပျော့စား ဟိုက်ဒရိုဂျင်နှောင်ကြိုးနှင့် နူးညံ့သော အီလက်ထရောနစ် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများမှတစ်ဆင့် ပစ်မှတ်များနှင့် အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်သည်။ ၎င်းသည် ပြိုင်ဘက်ကင်းသော အလွန်ကောင်းမွန်သော biocompatibility ကိုပေးဆောင်သည်။ ၎င်းသည် ပြင်းထန်သော ရွှေ့ပြောင်းပေးသည့် အေးဂျင့်များကို အားကိုးခြင်းမရှိဘဲ ပစ်မှတ်များကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်း ပြောဆိုနိုင်စေပါသည်။ သမားရိုးကျ နေရာရွှေ့ပြောင်းခြင်းနည်းလမ်းများနှင့် ဆက်စပ်နေသော အဆောက်အဦဆိုင်ရာ ပျက်စီးယိုယွင်းမှုအန္တရာယ်များကို သင် လုံးဝရှောင်ကြဉ်ပါ။ အချိန်ကုန်၊ ငြီးငွေ့ဖွယ်ကောင်းသော ဖယ်ရှားခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်များသည် လုံးဝ အသုံးမဝင်တော့ပါ။

ဆန်ခါတင်စာရင်းတွင် လော့ဂျစ်

ရှုပ်ထွေးသော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ဇီဝဗေဒကို ဦးစားပေးသော အထောက်အကူပြုပစ္စည်းများ သို့မဟုတ် ကုထုံးပရိုတင်း အကဲဖြတ်ခြင်းများသည် ပြင်းထန်သော စမ်းသပ်မှုတောင်းဆိုချက်များကို ရင်ဆိုင်နေရသည်။ ပြင်းထန်သောပတ်ဝန်းကျင်ကျန်းမာရေးနှင့် ဘေးကင်းလုံခြုံရေး (EHS) လိုက်နာမှုသည် အဖွဲ့အစည်းဆိုင်ရာခွင့်ပြုချက်များအတွက် အဓိကအရေးကြီးဆုံးဖြစ်သည်။ အဖွဲ့များသည် အစားထိုးမူပိုင်တဂ်များသို့ ပြောင်းရွှေ့ခြင်း၏ ROI ကို တိကျစွာတွက်ချက်သင့်သည်။ သမားရိုးကျ IMAC ရှင်းလင်းရေး အဆင့်များကို စံသတ်မှတ်ခြင်းသည် ပြင်းထန်သော လုပ်အား လိုအပ်ပြီး ကြားခံပမာဏများစွာကို စားသုံးပါသည်။ ရှောင်ကြဉ်ခြင်း။ imidazole သည် ထုတ်လုပ်မှု ပိုက်လိုင်းတစ်ခုလုံးကို မကြာခဏ ချောမွေ့စေသည်။ အလွန်အကဲဆတ်သော အောက်ပိုင်းစစ်ဆေးမှုများအတွက် အမြင့်ဆုံးဖြစ်နိုင်ချေကို သေချာစေသည်။

နိဂုံး

ကြားခံ-သွေးဆောင်သော ပရိုတိန်းမတည်မငြိမ်ဖြစ်စေသော ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ အစစ်အမှန်များကို ကျွန်ုပ်တို့ ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် လွှမ်းခြုံထားသည်။ ၎င်းသည် universal denaturant အဖြစ် မလုပ်ဆောင်သော်လည်း၊ လျော်ကန်စွာ အသုံးပြုခြင်းသည် ပရိုတင်း၏ သမာဓိကို ထိထိရောက်ရောက် ဖျက်ဆီးစေသည်။ အလွန်အကျွံအလုပ်လုပ်သောအာရုံစူးစိုက်မှု, သင့်လျော်သောနမူနာအပူပေးခြင်း, သို့မဟုတ်အထွေထွေခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပေါ့ဆမှု, စျေးကြီးသောစမ်းသပ်ဒေတာကိုပျက်စီးစေသည်။

သင့်ဓာတ်ခွဲခန်းအတွက် ဤတိုတိုတုတ်တုတ်၊ လုပ်ဆောင်မှုကို ဦးတည်သည့် နောက်အဆင့်များကို သုံးသပ်ကြည့်ပါ-

• မလိုအပ်သော အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားသော ဖယ်ထုတ်ခြင်း အဆင့်များအတွက် သင်၏ လက်ရှိ သန့်စင်ရေး ပရိုတိုကောများကို ချက်ချင်း စစ်ဆေးပါ။

• ဂျယ်အီလက်ထရိုဖိုရစီမစမီ ညင်သာသော 70°C အပူပေးသည့်အဆင့်ဖြင့် ပုံမှန်ပြုတ်နည်းများကို အစားထိုးပါ။

• ရေအောက်ပိုင်း optical quantification အလုပ်အသွားအလာအားလုံးကို Bradford assays သို့ အတိအကျပြောင်းပါ။

• အလွန်အကဲဆတ်သော အောက်ပိုင်းအပလီကေးရှင်းများအတွက် လုံးဝအခမဲ့ သို့မဟုတ် အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသော matrix ပလပ်ဖောင်းများကို အကဲဖြတ်ပါ။

အမြဲမေးလေ့ရှိသောမေးခွန်းများ

မေး- ပြုတ်ထားသော imidazole သည် ပရိုတင်းများကို ကျဆင်းစေပါသလား။

A: ဟုတ်ပါတယ်။ SDS-PAGE အတွက် 100°C သို့ အပူပေးခြင်းသည် အက်ဆစ်-labile နှောင်ကြိုးများကို ဟိုက်ဒရောလစ်ဖြစ်စေသည်။ 70°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ အပူပေးခြင်းသည် အကြံပြုထားသော ဘေးကင်းသော အခြားရွေးချယ်မှုဖြစ်သည်။

မေး- imidazole သည် A280 ပရိုတင်းပမာဏကို မည်သို့အကျိုးသက်ရောက်သနည်း။

A: Imidazole သည် 280 nm တွင် ပြင်းပြင်းထန်ထန် စုပ်ယူသည်။ ပုံမှန် elution ပြင်းအား (ဥပမာ၊ 250 mM) သည် 0.2 မှ 0.4 အတွင်း နောက်ခံအတုစုပ်ယူမှုကို မိတ်ဆက်နိုင်ပြီး မှားယွင်းသော မြင့်မားသောစာဖတ်ခြင်းကို ဖြစ်စေသည်။

မေး- ပရိုတင်းသန့်စင်မှုအတွက် imidazole ၏ အမြင့်ဆုံးလုံခြုံသောအာရုံစူးစိုက်မှုမှာ အဘယ်နည်း။

A- standard elution သည် 50-250 mM ကိုအသုံးပြုသော်လည်း၊ 1M အနီးသို့ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် ဆားဓာတ်မြင့်မားမှုကဲ့သို့ ပြုမူပြီး ပရိုတင်း-ပရိုတင်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေနိုင်ပြီး ပေါင်းစည်းမှုကို ဖြစ်စေသည်။

မေး- ပရိုတင်းတွေကို မသိမ်းဆည်းခင် imidazole ကို ဖယ်ရှားဖို့ လိုအပ်ပါသလား။

A- ရေရှည်တည်ငြိမ်မှုအတွက်၊ enzymatic assays သို့မဟုတ် vivo လေ့လာမှုများတွင်၊ imidazole ကို desolting columns သို့မဟုတ် dialysis မှတဆင့် imidazole ကို ကြာရှည်စွာထိတွေ့ခြင်းက မိုးရွာခြင်းနှင့်ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ပျံ့လွင့်ခြင်းတို့ကို ဖြစ်စေနိုင်သောကြောင့် ဖယ်ရှားသင့်ပါသည်။