Views: 0 Author: Site Editor ເວລາເຜີຍແຜ່: 2026-04-24 ຕົ້ນກໍາເນີດ: ເວັບໄຊ
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) ຍັງຄົງເປັນມາດຕະຖານສໍາລັບການຊໍາລະລ້າງໂປຣຕີນທີ່ມີປ້າຍຊື່ຂອງລາວໃນທົ່ວໂລກ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ນັກຄົ້ນຄວ້າມັກຈະປະເຊີນກັບຄວາມຫຍຸ້ງຍາກທີ່ຫນ້າເສົ້າໃຈໃນລະຫວ່າງການດໍາເນີນຂັ້ນຕອນຫ້ອງທົດລອງປົກກະຕິ. ພວກເຂົາເຈົ້າສັງເກດເຫັນການລວບລວມລົງລຸ່ມທີ່ບໍ່ຄາດຄິດ, ການສູນເສຍການເຮັດວຽກຂອງ enzymatic ຢ່າງກະທັນຫັນ, ແລະການແຍກຕົວທີ່ສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ບໍ່ຕ້ອງການ. ເຈົ້າອາດຈະສົງໄສວ່າ ທາດ elution ຂອງເຈົ້າທຳລາຍເປົ້າໝາຍທີ່ສະແດງອອກຢ່າງລະມັດລະວັງຂອງເຈົ້າຢ່າງຈິງຈັງຫຼືບໍ່. ຄວາມເປັນຈິງຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີຄວາມເຂົ້າໃຈ nuanced ສູງ. ສານເຄມີ imidazole ບໍ່ແມ່ນຢາ denaturant ຄລາສສິກເຊັ່ນ urea ຫຼື guanidine. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ມັນພ້ອມທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນທີ່ລະອຽດອ່ອນພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງການທົດລອງສະເພາະ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການຕ້ານທານ, ຄວາມກົດດັນທາງຄວາມຮ້ອນ, ຫຼືການສໍາຜັດທີ່ຍາວນານເຮັດໃຫ້ການຕິດຕໍ່ພົວພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສໍາຄັນເປັນປົກກະຕິ. ພວກເຮົາອອກແບບບົດຄວາມນີ້ເພື່ອໃຫ້ມີກອບຫຼັກຖານທີ່ຊັດເຈນສໍາລັບຫ້ອງທົດລອງຂອງທ່ານ. ທ່ານຈະໄດ້ຮຽນຮູ້ວິທີການກໍານົດຄວາມເສຍຫາຍໂຄງສ້າງຂອງ buffer-induced ຢ່າງຖືກຕ້ອງ. ພວກເຮົາຈະສະແດງໃຫ້ທ່ານເຫັນວິທີການເພີ່ມປະສິດທິພາບ buffers ບໍລິສຸດຂອງທ່ານ. ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາຈະປະເມີນແພລະຕະຟອມທາງເລືອກທີ່ປອດໄພກວ່າເພື່ອປົກປ້ອງການວິເຄາະທາງລຸ່ມທີ່ລະອຽດອ່ອນ.
ເກນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ elution ມາດຕະຖານ (50–250 mM) ໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນປອດໄພ, ແຕ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ສຸດ (~1M) ມີຜົນກະທົບທີ່ຄ້າຍຄືເກືອທີ່ລົບກວນປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກຄ່າໃຊ້ຈ່າຍ.
ຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການເຊື່ອມໂຊມຂອງຄວາມຮ້ອນ: ການຕົ້ມຕົວຢ່າງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີ imidazole ສໍາລັບ SDS-PAGE ເຮັດໃຫ້ເກີດ hydrolysis ພັນທະບັດອາຊິດ-labile, ນໍາໄປສູ່ການທໍາລາຍເປົ້າຫມາຍ.
ການແຊກແຊງໃນການວິເຄາະ: Imidazole ດູດເອົາແສງ UV ຢ່າງແຂງແຮງຢູ່ທີ່ 280 nm (ເຮັດໃຫ້ຂໍ້ມູນຜົນຜະລິດທີ່ເປັນບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ) ແລະແຊກແຊງກັບການວິເຄາະທີ່ອີງໃສ່ທອງແດງ (Lowry, Biuret).
ທາງເລືອກໃນຂະບວນການ: ການຫັນປ່ຽນໄປສູ່ຢາງທີ່ອີງໃສ່ Cobalt ຫຼຸດລົງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ imidazole ທີ່ຕ້ອງການ, ໃນຂະນະທີ່ຊິລິກາ / Lysine matrices ລຸ້ນໃຫມ່ຈະກໍາຈັດຄວາມຕ້ອງການ imidazole ທັງຫມົດ.
ທີມງານຫ້ອງທົດລອງມັກຈະຕໍ່ສູ້ກັບຄວາມແຕກຕ່າງກັນລະຫວ່າງຄວາມບໍ່ສະຖຽນລະພາບຂອງເປົ້າຫມາຍທໍາມະຊາດແລະການເກີດຈາກເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ. ການວິນິດໄສບັນຫາສະເພາະນີ້ຜິດພາດເຮັດໃຫ້ຂໍ້ມູນຊີວະວິທະຍາໂຄງສ້າງຖືກທໍາລາຍ. ມັນຍັງຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການດໍາເນີນການທົດລອງທີ່ກວ້າງຂວາງ, ໃຊ້ເວລາຫຼາຍ. ຄວາມເຂົ້າໃຈຢ່າງແທ້ຈິງວ່າ buffers ມີຜົນກະທົບແນວໃດຕໍ່ທາດໂປຼຕີນຂອງທ່ານປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ເກີດຄວາມລົ້ມເຫຼວໃນການດໍາເນີນງານທີ່ສໍາຄັນເຫຼົ່ານີ້.
ການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປັບຕົວແມ່ນມີຄວາມເປັນດ່າງສູງພາຍໃນ. ການບໍ່ປະຕິບັດ titrate elution buffers ຢ່າງຖືກຕ້ອງເຮັດໃຫ້ pH ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງກະທັນຫັນ, ຢ່າງໄວວາເມື່ອໃຊ້ຖັນ. ການປ່ຽນແປງທີ່ຮຸນແຮງນີ້ເຮັດໃຫ້ເກີດການເປີດເຜີຍໃນທ້ອງຖິ່ນພາຍໃນໂຄງສ້າງຂັ້ນສາມ. ສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນທີ່ອ່ອນໂຍນ dissociate ຢ່າງໄວວາໃນສະພາບແວດລ້ອມທີ່ຮຸນແຮງດັ່ງກ່າວ. ກວດສອບ pH buffer ຂອງທ່ານຢ່າງລະມັດລະວັງສະເໝີ ກ່ອນທີ່ຈະດໍາເນີນຂັ້ນຕອນ elution ໃດ.
ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຫຼາຍເກີນໄປແນະນໍາໄພຂົ່ມຂູ່ທີ່ເຊື່ອງໄວ້ອີກອັນຫນຶ່ງທີ່ເປັນອັນຕະລາຍຕໍ່ຄວາມສົມບູນຂອງຕົວຢ່າງ. ເມື່ອລະດັບ molar ເຂົ້າໃກ້ 1M, ການແກ້ໄຂຈະປະຕິບັດຕົວທັງຫມົດເປັນຕົວລະລາຍທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມແຂງສູງ ionic. ຜົນກະທົບ 'ເກືອສູງ' ການອອກສຽງນີ້ໂດຍກົງລົບກວນການໂຕ້ຕອບ electrostatic ອ່ອນແອ. ພັນທະບັດ Polar ທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບການຮັກສາຄວາມສອດຄ່ອງພື້ນເມືອງທໍາລາຍຫມົດ. ມັນປ່ຽນແປງເປືອກ hydration ທີ່ຢູ່ອ້ອມຮອບໂມເລກຸນທາດໂປຼຕີນ. ດັ່ງນັ້ນ, ປະຕິສໍາພັນທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນທີ່ສໍາຄັນ (PPIs) ລົ້ມເຫລວທີ່ຈະຖືສະລັບສັບຊ້ອນ multimeric ຮ່ວມກັນ.
ສຸດທ້າຍ, ການປູກຝັງທີ່ຂະຫຍາຍອອກຫຼັງ elution ສົ່ງເສີມການລອຍຕົວແບບຊ້າໆ. ທາດໂປຼຕີນຈາກເປົ້າຫມາຍອາດຈະ precipitate ອອກຈາກການແກ້ໄຂໃນໄລຍະເວລາ. ທ່ານອາດຈະສັງເກດເຫັນການລວບລວມຢ່າງຫນັກໃນລະຫວ່າງການ dialysis ຕໍ່ມາຫຼືຂັ້ນຕອນການເກັບຮັກສາໃນໄລຍະຍາວ. ການປະມວນຜົນຊິ້ນສ່ວນທີ່ໂດດເດັ່ນຂອງເຈົ້າຈະຈຳກັດໜ້າຈໍການຮັບແສງອັນຕະລາຍນີ້ທັນທີ. ການຖອກທ້ອງຢ່າງຮີບດ່ວນຮັບປະກັນໂປຣຕີນຂອງທ່ານຮັກສາສະພາບເດີມທີ່ເປັນປະໂຫຍດຂອງເຂົາເຈົ້າ.
deviations ອະນຸສັນຍາເລື້ອຍໆທໍາລາຍການຊໍາລະລ້າງຢ່າງສົມບູນ. ພວກເຮົາໄດ້ລະບຸສາມຄວາມຜິດພາດຂະບວນການທີ່ສໍາຄັນທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດການປ່ຽນແປງທີ່ບໍ່ຕ້ອງການ. ການຫຼີກເວັ້ນຄວາມຜິດພາດເຫຼົ່ານີ້ປັບປຸງຄວາມສອດຄ່ອງຂອງການທົດລອງຂອງທ່ານຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.
ຂໍ້ຜິດພາດ 1: ການຕົ້ມຕົວຢ່າງສໍາລັບ SDS-PAGE.
ຄວາມສ່ຽງ: ນັກຄົ້ນຄວ້າໄດ້ຕົ້ມຕົວຢ່າງປົກກະຕິຢູ່ທີ່ 100 ° C ກ່ອນທີ່ຈະແລ່ນ gels. ຕົວຢ່າງຕົ້ມໂດຍກົງທີ່ບັນຈຸຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ elution ສູງ cleaves ພັນທະບັດອາຊິດ-labile ທີ່ລະອຽດອ່ອນ. ລະດັບ reagent ສູງເລັ່ງ hydrolysis ທໍາລາຍນີ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ທ່ານແນ່ນອນຈະເຫັນການເຊື່ອມໂຊມຂອງແຖບທີ່ເຫັນໄດ້ແລະການ smearing ສຸດ gels ຜົນໄດ້ຮັບຂອງທ່ານ.
ການແກ້ໄຂ: Incubate ຕົວຢ່າງຂອງທ່ານທີ່ 70°C ສໍາລັບການແນ່ນອນ 5 ນາທີແທນທີ່ຈະ. ວິທີການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນທີ່ອ່ອນໂຍນນີ້ເຮັດໃຫ້ທາດໂປຼຕີນຈາກ electrophoresis ຢ່າງປອດໄພໂດຍບໍ່ມີການທໍາລາຍສານເຄມີ. ທ່ານບັນລຸວົງດົນຕີທີ່ຊັດເຈນ, ຖືກຕ້ອງເປັນຕົວແທນຂອງຜົນຜະລິດຕົວຈິງຂອງທ່ານ.
ຂໍ້ຜິດພາດ 2: ອີງໃສ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ Imidazole ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫາຄວາມບໍ່ສະອາດ.
ຄວາມສ່ຽງ: ບາງຄັ້ງຜູ້ປະຕິບັດການຍູ້ elution buffers ເກີນ 500 mM ໂດຍບໍ່ຈໍາເປັນ. ພວກເຂົາເຈົ້າພະຍາຍາມບັງຄັບເປົ້າຫມາຍທີ່ດື້ດ້ານອອກຈາກຖັນແທນທີ່ຈະເພີ່ມປະສິດທິພາບການຜູກມັດ. ວິທີການທີ່ມີມືຫນັກນີ້ເຮັດໃຫ້ສະຖຽນລະພາບຂອງ ions ໂລຫະອອກຈາກ metalloproteins, ການສ້າງ apoproteins ທີ່ບໍ່ມີປະໂຫຍດ. ມັນຍັງເພີ່ມຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການເປັນພິດຂອງເຊນລູລາສໍາລັບການວິເຄາະໃນ vivo ລຸ່ມນ້ໍາ.
ການແກ້ໄຂ: ປັບປຸງຂັ້ນຕອນການລ້າງເບື້ອງຕົ້ນຂອງທ່ານແທນທີ່ຈະເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມແຂງຂອງ elution. ແກ້ໄຂການຜູກມັດທີ່ບໍ່ສະເພາະໂດຍການຈັບຄູ່ປະລິມານຖັນ (CV) ຢ່າງເຂັ້ມງວດກັບການໂຫຼດທາດໂປຼຕີນທີ່ແທ້ຈິງ. ການເພີ່ມ 200-500 mM Arginine ສະຫນອງການລົບກວນ electrostatic ທີ່ດີເລີດຂອງ impurities. ອີກທາງເລືອກ, ການລ້າງດ້ວຍ 1-4 mM ATP ສົບຜົນສໍາເລັດຈະປ່ອຍ chaperones ໂມເລກຸນທີ່ບໍລິສຸດອອກຈາກເປົ້າຫມາຍຂອງທ່ານ.
ຂໍ້ຜິດພາດ 3: ການລະເລີຍ Histidine Protonation States.
ຄວາມສ່ຽງ: Buffer pH ຄວບຄຸມກົນໄກການຜູກມັດທາງດ້ານຮ່າງກາຍຢ່າງສົມບູນ. ການຫຼຸດລົງ pH ຕ່ໍາເກີນໄປໃນລະຫວ່າງການຜູກມັດຫຼືລ້າງຈະປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ Histidine deprotonation ທີ່ສໍາຄັນ. ການເຂົ້າໃກ້ຈຸດ isoelectric ນໍາໄປສູ່ການ elution ເປົ້າຫມາຍກ່ອນໄວອັນຄວນ. ທາດໂປຼຕີນອາດຈະຕົກອອກຈາກຢາງທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າຫຼາຍ, ບາງຄັ້ງພຽງແຕ່ 10 mM. ນີ້ບັງຄັບໃຫ້ຜູ້ປະຕິບັດການປ່ຽນແປງມາດຕະຖານມາດຕະຖານທີ່ເປັນອັນຕະລາຍພຽງແຕ່ເພື່ອເກັບກໍາຜົນຜະລິດຂອງພວກເຂົາ. ທ່ານຕ້ອງຮັບປະກັນ pH buffer ຂອງທ່ານຍັງຄົງຢູ່ຫຼືສູງກວ່າ 7.5 ເພື່ອຮັກສາສະຖານະຄ່າສາກທີ່ເຫມາະສົມ.
ທ່ານຕ້ອງປະເມີນວ່າອົງປະກອບຂອງບັຟເຟີທີ່ຕົກຄ້າງເຮັດໃຫ້ການປະເມີນການວິເຄາະທາງລຸ່ມແນວໃດ. ການວັດແທກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງທໍາລາຍໄລຍະທົດລອງຕໍ່ໄປແລະເສຍຊັບພະຍາກອນຫ້ອງທົດລອງທີ່ມີຄຸນຄ່າ.
ຂະຫນາດການປະເມີນຜົນ: ຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງປະລິມານ
ທາດ reagent ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄຸນລັກສະນະການດູດຊຶມ UV ພາຍໃນທີ່ແຂງແຮງພິເສດ. buffer elution ປົກກະຕິ 250 mM ຈະສ້າງພື້ນຫຼັງ $A_{280}$ ຕັ້ງແຕ່ 0.2 ຫາ 0.4. ປະກົດການທາງກາຍະພາບນີ້ເຮັດໃຫ້ການຄຳນວນຜົນຕອບແທນຂອງເປົ້າໝາຍທີ່ສູງຂື້ນໂດຍປອມ. ເຈົ້າອາດຈະຄິດວ່າເຈົ້າໄດ້ຜະລິດໂປຣຕີນຫຼາຍກວ່າທີ່ມີຢູ່ໃນທໍ່ນັ້ນ.
ຍຸດທະສາດການແກ້ໄຂ: ຫວ່າງເປົ່າ spectrophotometer ຂອງທ່ານຢ່າງລະມັດລະວັງສະເໝີ. ທ່ານຕ້ອງໃຊ້ອົງປະກອບທີ່ແນ່ນອນຂອງ elution buffer ເປັນການອ້າງອີງຂອງທ່ານຫວ່າງເປົ່າ. ອີກທາງເລືອກ, ປ່ຽນຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງທ່ານໄປສູ່ການທົດສອບ Bradford. ວິທີການທີ່ອີງໃສ່ Coomassie ທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ນີ້ຕ້ານການແຊກແຊງທາງ optical ສະເພາະຢ່າງມີປະສິດທິພາບສູງ. ທ່ານຄວນຫລີກລ້ຽງວິທີການຫຼຸດຜ່ອນທອງແດງຢ່າງສົມບູນເຊັ່ນ Lowry ແລະ Biuret ການວິເຄາະ. ສານເຄມີໂດຍປົກກະຕິຫຼຸດຜ່ອນ ions ທອງແດງ, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດຄວາມລົ້ມເຫຼວໃນປະລິມານຂະຫນາດໃຫຍ່.
ຂະໜາດການປະເມີນຜົນ: ການວິເຄາະດ້ານໂຄງສ້າງ ແລະ ໜ້າທີ່
ໂມເລກຸນທີ່ຕົກຄ້າງໄດ້ແຂ່ງຂັນກັນຢ່າງແຂງແຮງສໍາລັບສະຖານທີ່ຜູກມັດໂລຫະທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນໂລຫະປະສົມທີ່ສັບສົນ. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ພວກເຂົາສາມາດເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນການລົບກວນ endocrine ທີ່ມີທ່າແຮງໃນການວິເຄາະທາງຊີວະພາບຂອງເຊນທີ່ອ່ອນໄຫວຫຼືຢູ່ໃນ vivo. ການປ່ອຍໃຫ້ພວກມັນໄຫຼວຽນຢູ່ໃນຕົວຢ່າງຂອງເຈົ້າໂດຍກົງເຮັດໃຫ້ຄວາມກ່ຽວຂ້ອງທາງດ້ານສະລີລະວິທະຍາແລະຄວາມສົມບູນຂອງຂໍ້ມູນໂຄງສ້າງ.
ອະນຸສັນຍາການກຳຈັດ: ເມື່ອປະເມີນຄວາມເປັນໄປໄດ້ທາງຊີວະພາບລຸ່ມນ້ຳ, ບັງຄັບໃຫ້ກຳຈັດສານຕົກຄ້າງໃນທັນທີ. ໃຊ້ຖັນການຍົກເວັ້ນຂະໜາດຢ່າງວ່ອງໄວເພື່ອເວລາການຫັນປ່ຽນໄວ. Centrifugal ultrafiltration ແລະ dialysis ຂ້າມຄືນຍັງເຮັດວຽກໄດ້ດີພິເສດສໍາລັບການລ້າງຕົວຢ່າງຢ່າງລະອຽດກ່ອນທີ່ຈະທົດສອບ enzymatic.
ປະເພດການວິເຄາະ |
ລະດັບການແຊກແຊງ |
ກົນໄກການແຊກແຊງ |
ຄໍາແນະນໍາ |
|---|---|---|---|
A280 (ການດູດຊຶມ UV) |
ສູງ |
ການດູດຊຶມພາຍໃນທີ່ເຂັ້ມແຂງຢູ່ທີ່ 280 nm |
ເປົ່າຫວ່າງຢ່າງລະມັດລະວັງຫຼືຫຼີກເວັ້ນ |
Bradford (Coomassie) |
ຕໍ່າ |
ປະຕິສໍາພັນຫນ້ອຍທີ່ສຸດກັບການຜູກມັດສີຍ້ອມ |
ແນະນໍາໃຫ້ສູງ |
Lowry / Biuret |
ຮ້າຍແຮງ |
ຫຼຸດຜ່ອນທອງແດງ, ປ້ອງກັນການປ່ຽນສີ |
ຢ່າໃຊ້ |
ການຫຼຸດຜ່ອນການເປີດເຜີຍຢ່າງມີປະສິດທິພາບປົກປ້ອງຜົນຜະລິດທີ່ເປັນປະໂຫຍດສຸດທ້າຍຂອງທ່ານ. ທ່ານສາມາດປັບປຸງຂະບວນການຫ້ອງທົດລອງໂດຍນໍາໃຊ້ຍຸດທະສາດທີ່ມີເປົ້າຫມາຍສູງ, ການພິສູດຫຼາຍ.
ການແກ້ໄຂປະເພດ 1: ການປ່ຽນໄປໃຊ້ລະບົບ IMAC ທີ່ໃຊ້ Cobalt
ຢາງ Cobalt ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມສະເພາະເຈາະຈົງຂອງເປົ້າຫມາຍທີ່ສູງກວ່າເມື່ອທຽບກັບ Matrices Ni-NTA ມາດຕະຖານ. ພວກມັນມີເກນຄວາມສຳພັນທີ່ຕໍ່າກວ່າຕາມທຳມະຊາດສຳລັບໂປຣຕີນເຈົ້າພາບໃນພື້ນຫຼັງ. ຄວາມເປັນຈິງທາງເຄມີທີ່ແຕກຕ່າງກັນນີ້ອະນຸຍາດໃຫ້ສໍາລັບ elution ອັນບໍລິສຸດສູງທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ reagent ຕ່ໍາຫຼາຍ. ປົກກະຕິແລ້ວທ່ານຕ້ອງການພຽງແຕ່ປະມານ 150 mM ເພື່ອປົດປ່ອຍເປົ້າຫມາຍທີ່ຕ້ອງການຢ່າງສົມບູນ. ການຫຼຸດຜ່ອນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍນີ້ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມກົດດັນໂດຍລວມຂອງໂຄງສ້າງ enzyme ທີ່ລະອຽດອ່ອນ.
ການແກ້ໄຂປະເພດ 2: ຄວາມຈິງການຊໍາລະລ້າງໃຫ້ບໍລິສຸດ
ບາງທາດໂປຼຕີນທີ່ສະແດງອອກສູງປະກອບເປັນອົງປະກອບລວມທີ່ບໍ່ລະລາຍໂດຍພື້ນເມືອງ. ການປຸງແຕ່ງພວກມັນໃຫ້ມີປະສິດຕິຜົນຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີເງື່ອນໄຂ buffering ທີ່ຮຸນແຮງທີ່ສຸດ. ການນໍາໃຊ້ 6M Guanidine-HCl ຫຼື 8M Urea ກາຍເປັນຄວາມຈໍາເປັນຢ່າງເຂັ້ມງວດເພື່ອລະລາຍລວມເຫຼົ່ານີ້.
ຫມາຍເຫດການປະຕິບັດທີ່ສໍາຄັນ: ໂມເລກຸນ elution ຕົ້ນຕໍບໍ່ໄດ້ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນຕົວເຮັດຄວາມສະອາດຂອງ denaturant ໃນສະຖານະການທີ່ສັບສົນເຫຼົ່ານີ້. ທາດເສື່ອມເສີຍຢ່າງໜັກຈະປ່ຽນແປງໂປຣໄຟລ໌ການຜູກມັດທາງຮ່າງກາຍທັງໝົດໂດຍພື້ນຖານ. ຖ້າທ່ານໃຊ້ Guanidine ໃນລະຫວ່າງການເຮັດຄວາມສະອາດ, ທ່ານຕ້ອງລ້າງຕົວຢ່າງເຂົ້າໄປໃນ Urea ກ່ອນທີ່ຈະດໍາເນີນການ SDS-PAGE. ຂັ້ນຕອນບັງຄັບນີ້ປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ເກີດການຕົກຕະລຶງໄພພິບັດເມື່ອປະສົມກັບ buffers ມາດຕະຖານ.
ການແກ້ໄຂປະເພດ 3: Buffer Stabilizers
ສະລັບສັບຊ້ອນຫຼາຍ subunit ບາງຢ່າງຍັງຄົງມີຄວາມສ່ຽງສູງທີ່ຈະແຕກແຍກຢ່າງກະທັນຫັນ. ທ່ານຄວນເສີມສ້າງ buffers ຮ່ວມກັນຢ່າງເປັນປົກກະຕິເພື່ອຕ້ານກັບກໍາລັງທີ່ລົບກວນໃນລະຫວ່າງໄລຍະ elution ທີ່ສໍາຄັນ. ການເພີ່ມຕົວຄົງທີ່ທີ່ບໍ່ແມ່ນ ionic ເຊັ່ນ PEG ຫຼື glycerol ສະຫນອງການສະຫນັບສະຫນູນໂຄງສ້າງທີ່ຈໍາເປັນ. ສານເຕີມແຕ່ງເຫຼົ່ານີ້ປົກປ້ອງແຜ່ນແພ hydrophobic ແລະຮັກສາຄວາມສົມບູນແບບທົ່ວໂລກຕະຫຼອດການແລ່ນ.
ຍຸດທະສາດ |
ຜົນປະໂຫຍດເບື້ອງຕົ້ນ |
ກໍລະນີການນໍາໃຊ້ທີ່ດີທີ່ສຸດ |
|---|---|---|
ຢາງ Cobalt |
ຫຼຸດເກນການລົບ (~150 mM) |
ເປົ້າໝາຍທີ່ລະອຽດອ່ອນມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະລວມຕົວກັນ |
Urea/Guanidine ເພີ່ມ |
Solubilizes ອົງການຈັດຕັ້ງລວມ |
ການສະແດງອອກທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ລະລາຍ |
PEG / Glycerol Buffering |
ປ້ອງກັນການ dissociation ສະລັບສັບຊ້ອນ |
ສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນຫຼາຍ subunit |
ບັນຫາທຸລະກິດ
ການກວດສອບລະບຽບກ່ຽວກັບຄວາມປອດໄພຂອງຫ້ອງທົດລອງທົ່ວໄປຍັງສືບຕໍ່ເພີ່ມຂຶ້ນໃນທົ່ວໂລກ. ທາດປະສົມເຄມີແບບດັ້ງເດີມມີເອກະສານທີ່ເປັນພິດຕໍ່ການຈະເລີນພັນແລະຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການຂັດຂວາງ endocrine. ນອກຈາກນັ້ນ, ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍສູງຂອງຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງນ້ໍາຕົກຍ້ອນການຮົ່ວໄຫຼຂອງໂລຫະຫນັກເຮັດໃຫ້ເກີດສິ່ງທ້າທາຍໃນການດໍາເນີນງານທີ່ສໍາຄັນ. ການຜຸພັງຂອງ Nickel ມັກຈະທໍາລາຍທາດໂປຼຕີນຈາກການປິ່ນປົວທີ່ລະອຽດອ່ອນໃນໄລຍະການພັດທະນາຕໍ່ມາ. ສິ່ງອໍານວຍຄວາມສະດວກຕ້ອງການຂະບວນການເຮັດວຽກທີ່ປອດໄພກວ່າເພື່ອປົກປ້ອງທັງບຸກຄະລາກອນແລະການທົດລອງທີ່ມີຄຸນຄ່າ.
ໝວດໝູ່ການແກ້ໄຂ: ຢາງຊິລິກາ ແລະ ລີຊິນ ລຸ້ນຕໍ່ໄປ
ເກນການປະເມີນຜົນ: ການປ່ຽນແທນ matrices Ni-NTA ທີ່ລ້າສະໄຫມຈະກໍາຈັດອັນຕະລາຍທີ່ເປັນພິດຫຼາຍອັນພ້ອມກັນ. Matrices ທີ່ໃຊ້ຊິລິກາລຸ້ນຕໍ່ໄປໃຊ້ກົນໄກການຊໍາລະລ້າງ Lysine-mediated ສະເພາະສູງ. ການປ່ຽນແປງທີ່ທັນສະ ໄໝ ນີ້ ກຳ ຈັດຄວາມຕ້ອງການທີ່ເຂັ້ມງວດ ສຳ ລັບທາດປະສົມທີ່ໄວໄຟເຊັ່ນເອທານອນໃນລະຫວ່າງການເກັບຮັກສາໃນໄລຍະຍາວ. ທ່ານບັນລຸສະພາບແວດລ້ອມຫ້ອງທົດລອງທີ່ປອດໄພກວ່າຢ່າງຈະແຈ້ງ, ສອດຄ່ອງກັນຫຼາຍຂຶ້ນທັນທີ.
ຄຸນສົມບັດຕໍ່ກັບຜົນໄດ້ຮັບ: Lysine ພົວພັນກັບເປົ້າໝາຍໂດຍຜ່ານການຜູກມັດ hydrogen ອ່ອນໆ ແລະປະຕິສໍາພັນ electrostatic ທີ່ອ່ອນໂຍນ. ມັນສະຫນອງ biocompatibility ທີ່ດີເລີດທີ່ບໍ່ມີການປຽບທຽບ. ມັນອະນຸຍາດໃຫ້ບັນດາເປົ້າໝາຍສາມາດຫຼອກລວງໄດ້ຢ່າງສະອາດ ໂດຍບໍ່ມີການອີງໃສ່ຕົວແທນການຍົກຍ້າຍທີ່ຮຸກຮານ. ທ່ານຫລີກລ້ຽງຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການເຊື່ອມໂຊມຂອງໂຄງສ້າງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບວິທີການຍົກຍ້າຍແບບດັ້ງເດີມຢ່າງສົມບູນ. ຂະບວນການໂຍກຍ້າຍທີ່ໃຊ້ເວລາຫຼາຍ, ເມື່ອຍລ້າກາຍເປັນສິ່ງທີ່ລ້າສະໄຫມທັງຫມົດ.
Shortlisting Logic
ສິ່ງອໍານວຍຄວາມສະດວກໃຫ້ຄວາມສໍາຄັນທາງດ້ານຊີວະສາດໂຄງສ້າງທີ່ຊັບຊ້ອນຫຼືການປະເມີນທາດໂປຼຕີນຈາກການປິ່ນປົວປະເຊີນກັບຄວາມຕ້ອງການການທົດລອງທີ່ເຂັ້ມງວດເປັນພິເສດ. ການປະຕິບັດຕາມຢ່າງເຂັ້ມງວດດ້ານສຸຂະພາບ ແລະຄວາມປອດໄພສິ່ງແວດລ້ອມ (EHS) ຍັງຄົງເປັນສິ່ງສຳຄັນທີ່ສຸດສຳລັບການອະນຸມັດຈາກສະຖາບັນ. ທີມງານຄວນຄິດໄລ່ ROI ຢ່າງຖືກຕ້ອງຂອງການເຄື່ອນຍ້າຍໄປຫາແທັກທີ່ເປັນເຈົ້າຂອງທາງເລືອກທັງຫມົດ. ການສ້າງມາດຕະຖານຂັ້ນຕອນການທໍາຄວາມສະອາດ IMAC ແບບດັ້ງເດີມຕ້ອງການແຮງງານທີ່ເຂັ້ມຂຸ້ນແລະບໍລິໂພກເປັນຈໍານວນຫຼວງຫຼາຍຂອງ buffer. ຫຼີກເວັ້ນ imidazole ຮ່ວມກັນມັກຈະປັບປຸງທໍ່ການຜະລິດທັງຫມົດ. ມັນຮັບປະກັນຄວາມເປັນໄປໄດ້ສູງສຸດສໍາລັບການວິເຄາະທາງລຸ່ມທີ່ມີຄວາມລະອຽດອ່ອນສູງ.
ພວກເຮົາໄດ້ກວມເອົາຄວາມເປັນຈິງທາງເຄມີ nuanced ຂອງຄວາມບໍ່ຫມັ້ນຄົງທາດໂປຼຕີນຈາກ buffer, induced. ໃນຂະນະທີ່ມັນບໍ່ໄດ້ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນ denaturant ທົ່ວໄປ, ການນໍາໃຊ້ທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງທໍາລາຍຄວາມສົມບູນຂອງທາດໂປຼຕີນ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງການເຮັດວຽກຫຼາຍເກີນໄປ, ການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຂອງຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ເຫມາະສົມ, ຫຼືການລະເລີຍການວິເຄາະທົ່ວໄປເຮັດໃຫ້ຂໍ້ມູນການທົດລອງທີ່ມີລາຄາແພງ.
ພິຈາລະນາຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປທີ່ຊັດເຈນ, ຮັດກຸມເຫຼົ່ານີ້ສໍາລັບຫ້ອງທົດລອງຂອງທ່ານ:
ກວດສອບໂປໂຕຄອນການຊໍາລະລ້າງປະຈຸບັນຂອງທ່ານທັນທີສໍາລັບຂັ້ນຕອນ elution ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງທີ່ບໍ່ຈໍາເປັນ.
ທົດແທນວິທີການຕົ້ມມາດຕະຖານດ້ວຍຂັ້ນຕອນການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນ 70 ອົງສາ C ອ່ອນໆກ່ອນ gel electrophoresis.
ປ່ຽນຂະບວນການເຮັດວຽກດ້ານປະລິມານ optical ລຸ່ມທັງໝົດຢ່າງເຂັ້ມງວດຕໍ່ກັບການວິເຄາະ Bradford.
ປະເມີນແພລະຕະຟອມ matrix ຟຣີທັງໝົດ ຫຼືຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າສຳລັບແອັບພລິເຄຊັນລຸ່ມນ້ຳທີ່ລະອຽດອ່ອນສູງ.
A: ແມ່ນແລ້ວ. ການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນ buffers ທີ່ມີ imidazole ເປັນ 100 ° C ສໍາລັບ SDS-PAGE hydrolyzes acid-labile bonds. ການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 70 ° C ເປັນເວລາ 5 ນາທີແມ່ນທາງເລືອກທີ່ປອດໄພທີ່ແນະນໍາ.
A: Imidazole ດູດຊຶມຢ່າງແຂງແຮງຢູ່ທີ່ 280 nm. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ elution ປົກກະຕິ (ຕົວຢ່າງ: 250 mM) ສາມາດແນະນໍາການດູດຊຶມພື້ນຫລັງປອມຂອງ 0.2 ຫາ 0.4, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດການອ່ານທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງສູງ.
A: ໃນຂະນະທີ່ elution ມາດຕະຖານໃຊ້ 50-250 mM, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນເຂົ້າໃກ້ 1M ເຮັດຫນ້າທີ່ຄ້າຍຄືເກືອສູງແລະສາມາດລົບກວນປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນແລະເຮັດໃຫ້ເກີດການລວບລວມ.
A: ສໍາລັບຄວາມຫມັ້ນຄົງໃນໄລຍະຍາວ, ການວິເຄາະ enzymatic, ຫຼືໃນການສຶກສາ vivo, imidazole ຄວນໄດ້ຮັບການໂຍກຍ້າຍອອກໂດຍຜ່ານຖັນ desalting ຫຼື dialysis, ເນື່ອງຈາກວ່າການສໍາຜັດເປັນເວລາດົນນານສາມາດນໍາໄປສູ່ການ precipitation ແລະ drift ໂຄງສ້າງ.
