តើ Imidazole ភ្ជាប់ជាមួយនីកែលយ៉ាងដូចម្តេច?

ទិន្នផលការបន្សុតប្រូតេអ៊ីនដែលមិនស៊ីសង្វាក់គ្នា ជារឿយៗធ្វើឱ្យអ្នកចាត់ចែងមន្ទីរពិសោធន៍ខកចិត្ត។ វិស្វករកែច្នៃផ្នែកខាងក្រោមជាច្រើនប្រឈមនឹងភាពបរិសុទ្ធមិនល្អ ឬការបាត់បង់គោលដៅដែលមិនបានរំពឹងទុកជារៀងរាល់ថ្ងៃ។ ពួកគេច្រើនតែពឹងផ្អែកលើពិធីការទូទៅជាជាងការលៃតម្រូវការប្រមូលផ្តុំសតិបណ្ដោះអាសន្នដើម្បីផ្គូផ្គងគីមីសាស្ត្រសំរបសំរួលជាក់លាក់។ Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) ទាមទារភាពជាក់លាក់ដាច់ខាត។ ប្រសិនបើអ្នកមិនអើពើនឹងសក្ដានុពលនៃការចងតែមួយគត់នៃម៉ូលេគុលគោលដៅរបស់អ្នក នោះអ្នកប្រថុយនឹងការស្ទះលំហូរការងារធ្ងន់ធ្ងរ។ អត្ថបទនេះបង្ហាញពីទំនាក់ទំនងរចនាសម្ព័ន្ធជាមូលដ្ឋានរវាង imidazole និងនីកែល។ យើងផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងរលូនពីយន្តការទ្រឹស្តីត្រង់ទៅលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យជ្រើសរើសជ័រជាក់ស្តែង។ អ្នកនឹងរកឃើញក្របខ័ណ្ឌផ្អែកលើភស្តុតាងសម្រាប់ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពពិធីការ elution ស្លាករបស់គាត់។ យើងក៏គ្របដណ្តប់ផងដែរអំពីរបៀបដោះស្រាយបញ្ហាការបរាជ័យនៃការបន្សុតទូទៅប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព។ ការយល់ដឹងអំពីគីមីសាស្ត្រសំខាន់នេះបំប្លែងលទ្ធផលពិសោធន៍ដែលមិនអាចទាយទុកជាមុនបានទៅជាដំណើរការចុះក្រោមដែលអាចទុកចិត្តបានខ្ពស់ដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបាន។

គន្លឹះដក

• ការធ្វើត្រាប់តាមរចនាសម្ព័ន្ធ៖ អ៊ីមីដាហ្សូលអាចប្រកួតប្រជែងស្លាកអ៊ីស្ទីឌីន ពីព្រោះរចនាសម្ព័ន្ធរង្វង់ដែលមានសមាជិកប្រាំរបស់វាដើរតួជាមូលដ្ឋាន Lewis ប្រមូលផ្តុំ ដោយផ្លាស់ប្តូរប្រូតេអ៊ីនគោលដៅដោយផ្ទាល់នៅកន្លែងសំរបសំរួលនីកែល។

• បញ្ហាការជ្រើសរើសជ័រ៖ ស្ថេរភាពនៃអន្តរកម្មនីកែល-អ៊ីមីដាហ្សូល ពឹងផ្អែកយ៉ាងខ្លាំងទៅលើជាតិគីមីដែលប្រើ (ឧទាហរណ៍ 4-dentate NTA ការពារការលេចធ្លាយដែកបានល្អជាង 3-dentate IDA)។

• ការផ្តោតអារម្មណ៍ជាឧបករណ៍បញ្ជា៖ ការលៃតម្រូវភាពជាក់លាក់នៃ imidazole កំឡុងពេលចង (10-25 mM) ទប់ស្កាត់ការជ្រៀតជ្រែកប្រូតេអ៊ីនរបស់ម៉ាស៊ីន ខណៈពេលដែលកំហាប់ខ្ពស់ (200-500 mM) ជំរុញការបំប្លែងគោលដៅ។

• លើសពីគីមីវិទ្យា៖ កត្តារូបវិទ្យាដូចជា 'ឥទ្ធិពលតិត្ថិភាព' (បរិមាណជ័រធៀបនឹងម៉ាសប្រូតេអ៊ីន) គឺមានសារៈសំខាន់ដូចទៅនឹងគីមីសាស្ត្របណ្តោះអាសន្នសម្រាប់ការសម្រេចបាននូវភាពបរិសុទ្ធខ្ពស់។

យន្តការម៉ូលេគុល៖ អាស៊ីត Lewis មូលដ្ឋាន និងការធ្វើត្រាប់តាមរចនាសម្ព័ន្ធ

អ្នកចាប់ផ្តើមដំបូងជាច្រើនសន្មត់ថាការទាក់ទាញអេឡិចត្រូស្តាតជំរុញការចងជួរឈរ។ ទេវកថាដ៏ពេញនិយមនេះបណ្តាលឱ្យមានកំហុសពិធីការរីករាលដាល។ នៅ pH សរីរវិទ្យា histidine នៅតែអព្យាក្រឹត។ អន្តរកម្មពិតប្រាកដពឹងផ្អែកទាំងស្រុងលើចំណងកូវ៉ាលេន។ យើងហៅវាថា Lewis acid-base chemistry ។ នៅក្នុងប្រព័ន្ធនេះ នីកែល immobilized ដើរតួជាអ្នកទទួលអេឡិចត្រុង។ អេឡិចត្រុងពីរគូនៅលើអាតូមអាសូតដើរតួជាអ្នកបរិច្ចាគសំខាន់។ អ្នកត្រូវតែយល់ពីយន្តការដែលមិនមែនជាអ៊ីយ៉ុងនេះ ដើម្បីស្ទាត់ជំនាញ IMAC elution។ ប្រសិនបើអ្នកចាត់ទុកប្រព័ន្ធដូចជាជួរឈរផ្លាស់ប្តូរអ៊ីយ៉ុងសាមញ្ញ ការបន្សុតរបស់អ្នកនឹងបរាជ័យ។

ការធ្វើត្រាប់តាមរចនាសម្ព័ន្ធបង្កើតជាគោលការណ៍ស្នូលនៃការផ្សារភ្ជាប់ការប្រកួតប្រជែង។ សូមក្រឡេកមើលធរណីមាត្រម៉ូលេគុលឱ្យបានដិតដល់។ ម៉ូលេគុលមុខងារដែលប្រើសម្រាប់ elution មើលទៅដូចគ្នាបេះបិទទៅនឹងខ្សែសង្វាក់ចំហៀងសកម្មនៃសំណល់ histidine ។ ពួកគេចែករំលែករចនាសម្ព័ន្ធចិញ្ចៀនដែលមានសមាជិកប្រាំដូចគ្នា។ នៅពេលអ្នកណែនាំដៃគូប្រកួតប្រជែងឥតគិតថ្លៃនេះទៅក្នុងប្រព័ន្ធ វាប្រយុទ្ធយ៉ាងសកម្មសម្រាប់កន្លែងទំនេរដូចគ្នា។ នីកែលអ៊ីយ៉ុងមិនអាចបែងចែករវាងចិញ្ចៀនសេរី និងប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាកបានទេ។ ពួកគេទាំងពីរបង្ហាញមុខដែលបរិច្ចាគអេឡិចត្រុងដូចគ្នាទៅនឹងមជ្ឈមណ្ឌលលោហៈ។

ដោយសារយន្តការនេះពឹងផ្អែកខ្លាំងលើការធ្វើត្រាប់តាមបែបប្រកួតប្រជែង ការបំភាន់ដោយជោគជ័យក្លាយជាល្បែងលេខសុទ្ធសាធ។ អ្នក​មាន​ចំនួន​ថេរ​នៃ​គេហទំព័រ​ចង​នីកែល​ដែល​អាច​ចូល​ដំណើរការ​បាន​នៅលើ​ជ័ររបស់អ្នក។ ស្លាក polyhistidine ភ្ជាប់យ៉ាងរឹងមាំដោយសារតែឥទ្ធិពល avidity នៃសំណល់ច្រើន។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ការជន់លិចជួរឈរត្រឡប់អត្ថប្រយោជន៍គណិតវិទ្យា។ ការប្រមូលផ្តុំដ៏ធំនៃឥតគិតថ្លៃ imidazole គ្របដណ្តប់បរិស្ថាន។ វាយកឈ្នះស្លាកដោយសាមញ្ញតាមរយៈវត្តមានម៉ូលេគុលលើសលប់។ ការផ្លាស់ទីលំនៅដ៏ធំនេះបង្ខំឱ្យប្រូតេអ៊ីនគោលដៅបញ្ចេញ និងហូរតាមជួរឈរ។

ការបកប្រែគីមីវិទ្យាចងទៅជាលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យជ្រើសរើសជ័រ

ការវាយតម្លៃធរណីមាត្រ chelator ប៉ះពាល់ដោយផ្ទាល់ដល់ទិន្នផលចុងក្រោយរបស់អ្នក។ ជ័រជំនួយរឹងត្រូវតែទប់អ៊ីយ៉ុងនីកែលឱ្យមានសុវត្ថិភាព។ អាស៊ីត Nitrilotriacetic ស្តង់ដារ (NTA) ប្រើប្រាស់កន្លែងសំរបសំរួលបឋមចំនួនបួន។ ការរៀបចំ tetradentate នេះ ទប់ដែកដោយសុវត្ថិភាព។ វាទុកកន្លែងសំរបសំរួលពីរយ៉ាងពិតប្រាកដសម្រាប់ស្លាក histidine ។ អាស៊ីត Iminodiacetic ចាស់ (IDA) ប្រើតែកន្លែងសម្របសម្រួលបីប៉ុណ្ណោះ។ IDA កាន់លោហៈកាន់តែរលុង។ NTA កំណត់ការលេចធ្លាយជាតិនីកែលដែលមិនចង់បានក្នុងកំឡុងដំណាក់កាល elution ប្រមូលផ្តុំខ្លាំង។ ការកាត់បន្ថយការលេចធ្លាយលោហៈនៅតែជាកត្តាអនុលោមភាពដ៏សំខាន់សម្រាប់ការផលិតឱសថខ្នាតធំ។

ខាងក្រោមនេះគឺជាតារាងសង្ខេបដែលប្រៀបធៀបថាមវន្តរចនាសម្ព័ន្ធនៃជ័រ IDA និង NTA៖

ជ័រ Chelator	គេហទំព័រសំរបសំរួលបានប្រើ	បើកគេហទំព័រសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន	ហានិភ័យនៃការលេចធ្លាយលោហៈ
IDA (អាស៊ីត Iminodiacetic)	3 (ត្រីកោណមាត្រ)	3	ខ្ពស់ (ជាពិសេសនៅមុំស្រួចខ្ពស់)
NTA (អាស៊ីត Nitrilotriacetic)	4 (តេត្រាដេត)	2	ទាប (ភ្ជាប់លោហៈផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងតឹង)

ការជ្រើសរើសលោហៈផ្លាស់ប្តូរត្រឹមត្រូវ ផ្លាស់ប្តូរភាពជាក់លាក់នៃមូលដ្ឋានរបស់អ្នក។ អ្នកត្រូវតែផ្គូផ្គងលោហៈទៅនឹងគោលដៅខាងក្រោមជាក់លាក់របស់អ្នក។ នីកែលតំណាងឱ្យស្តង់ដារឧស្សាហកម្មសម្រាប់សមត្ថភាពខ្ពស់។ វាគ្រប់គ្រងការចាប់យកគោលបំណងទូទៅយ៉ាងស្រស់ស្អាត។ Cobalt ផ្តល់នូវភាពស្អិតរមួតខ្សោយជាង។ អ្នក​ត្រូវការ​ម៉ូលេគុល​គូប្រជែង​តិច​ជាង​ដើម្បី​ទាញ​គោលដៅ​របស់អ្នក​ពី cobalt។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ cobalt ផ្តល់នូវភាពបរិសុទ្ធដ៏ល្អឥតខ្ចោះដោយការបដិសេធយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាពនូវប្រូតេអ៊ីនម៉ាស៊ីនផ្ទៃខាងក្រោយ។ ស្ពាន់ផ្តល់នូវកម្លាំងចងអតិបរមា ប៉ុន្តែផ្តល់នូវភាពជាក់លាក់ទាបបំផុត។ អ្នកគួរតែបម្រុងទុកទង់ដែងសម្រាប់កិច្ចការបង្កើនភាពសាមញ្ញដូចជាថ្នាំកូត ELISA ជាដើម។

អ៊ីយ៉ុងដែក	ភាពស្និទ្ធស្នាល។	ភាពជាក់លាក់	ករណីប្រើប្រាស់ល្អបំផុត
នីកែល (Ni2+)	ខ្ពស់។	មធ្យម	ការផលិតប្រូតេអ៊ីនស្តង់ដារ និងការចាប់យកទិន្នផលខ្ពស់។
Cobalt (Co2+)	មធ្យម	ខ្ពស់។	កម្មវិធីដែលមានភាពបរិសុទ្ធខ្ពស់ទាមទារសំលេងរំខានផ្ទៃខាងក្រោយទាប។
ស្ពាន់ (Cu2+)	ខ្ពស់ណាស់។	ទាប	ការវិភាគទាញចុះសាមញ្ញ និងការពង្រឹងមូលដ្ឋាន។

តម្លាភាពរបស់អ្នកលក់ទាក់ទងនឹងរង្វាស់បរិមាណទាមទារការយកចិត្តទុកដាក់យ៉ាងតឹងរឹងរបស់អ្នក។ អ្នកទិញជារឿយៗមិនអើពើព័ត៌មានលម្អិតអំពីការព្យួររាងកាយ។ ជ័រពាណិជ្ជកម្មស្ទើរតែតែងតែដឹកជញ្ជូនជា 50% aqueous suspensions ។ ពួកវាជាធម្មតាអណ្តែតនៅក្នុងដំណោះស្រាយការពារអេតាណុល។ មួយមីលីលីត្រនៃ 'បរិមាណគ្រែ' ដែលបានបញ្ជាក់ពិតជាតម្រូវឱ្យអ្នកចាក់ពីរមីលីលីត្រនៃសារធាតុរំអិលរាងកាយ។ ការខកខានក្នុងការគណនាសមាមាត្រនេះធ្វើឱ្យពាក់កណ្តាលសមត្ថភាពចងទ្រឹស្តីរបស់អ្នកភ្លាមៗ។ ការ​គណនា​នេះ​បង្ហាញ​ថា​ពិត​ជា​មាន​សារៈ​សំខាន់​សម្រាប់​លទ្ធកម្ម និង​ការ​ធ្វើ​មាត្រដ្ឋាន​ដំណើរការ។

ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពពិធីការ៖ វិស្វកម្មជម្រាល Imidazole

ការគ្រប់គ្រងភាពជាក់លាក់ក្នុងដំណាក់កាលចង និងលាងសម្អាតបំបែកការបន្សុតល្អពីវត្ថុដ៏អស្ចារ្យ។ អ្នកត្រូវតែណែនាំកម្រិតទាបរវាង 10 ទៅ 50 mM ក្នុងដំណាក់កាលផ្ទុកដំបូង។ ស្រទាប់គ្រឹះនេះយ៉ាងសកម្មកាន់កាប់កន្លែងចងខ្សោយ។ ប្រូតេអ៊ីនម៉ាស៊ីន Endogenous ជាញឹកញាប់មានបំណះ histidine ដែលបែកខ្ចាត់ខ្ចាយ។ Bovine Serum Albumin (BSA) និង immunoglobulins ចងមិនជាក់លាក់ទេ ប្រសិនបើមិនបានត្រួតពិនិត្យ។ កំហាប់ basal ទាប ដើរតួជា bouncer គីមី។ វាការពារយ៉ាងសកម្មនូវភាពមិនបរិសុទ្ធដ៏គួរឱ្យធុញទ្រាន់ទាំងនេះពីការជាប់ជាមួយម៉ាទ្រីស។

ដំណាក់កាល elution ទាមទារការផ្លាស់ប្តូរដ៏ធំនៅក្នុងឌីណាមិកប្រមូលផ្តុំ។ ជាធម្មតាអ្នកត្រូវការចន្លោះពី 200 ទៅ 500 mM ដើម្បីបំបែកស្មុគស្មាញ។ កម្រិត​ឈ្លានពាន​នេះ​បាន​ជន់​លិច​បរិស្ថាន​ក្នុង​តំបន់​ទាំងស្រុង។ ស្លាក polyhistidine មិនអាចរក្សាការក្តាប់របស់វាប្រឆាំងនឹងម៉ូលេគុលប្រកួតប្រជែងរាប់លានបានទេ។ អ្នក​អាច​អនុវត្ត​ការ​ផ្តោត​អារម្មណ៍​នេះ​ជា​ជំហាន​រំពេច ឬ​ជម្រាល​លីនេអ៊ែរ។ ជំហាន elutions បង្កើត កំពូល ច្បាស់ ជាង ប៉ុន្តែ ពេល ខ្លះ ទាញ ភាព មិនស្អាត នៅ តាម បណ្តោយ ។ ជម្រាល​លីនេអ៊ែរ​ផ្ដល់​គុណភាព​កម្រិត​កំពូល​បាន​ល្អ​ប្រសើរ​ជាង​មុន​ពេល​បំបែក​បំរែបំរួល​ពហុមេរិក​ដែល​ទាក់ទង​គ្នា​យ៉ាង​ជិត​ស្និទ្ធ។

ឧបសគ្គភាពឆបគ្នានៃគីមីកំណត់កំណត់ទម្រង់សតិបណ្ដោះអាសន្នរបស់អ្នកយ៉ាងខ្លាំង។ សារធាតុបន្ថែមទូទៅមួយចំនួនបំផ្លាញបរិយាកាសសម្របសម្រួលដ៏ឆ្ងាញ់ទាំងស្រុង។ អ្នកត្រូវតែត្រួតពិនិត្យសវនកម្មលីសស័ររបស់អ្នកឱ្យបានហ្មត់ចត់មុនពេលផ្ទុក។

• ភ្នាក់ងារកាត់បន្ថយ៖ រក្សា Dithiothreitol (DTT) ក្រោម 5 mM។ បរិមាណខ្ពស់កាត់បន្ថយអ៊ីយ៉ុងដែកយ៉ាងសកម្ម។ អ្នក​នឹង​ឃើញ​ជ័រ​ប្រែ​ពណ៌​ត្នោត​មិន​ស្អាត។

• Chelators ខ្លាំង៖ រក្សា EDTA ក្រោម 1 mM។ EDTA ដើរតួជា hexadentate chelator ។ វាច្រូតលោហៈដោយផ្ទាល់ចេញពីម៉ាទ្រីស NTA ។ ជ័រនឹងប្រែជាពណ៌ស។

• Amines បឋម៖ ជៀសវាង Tris buffer បើអាចធ្វើបាន។ ម៉ូលេគុលខ្ពស់ Tris អាចធ្វើអន្តរកម្មខ្សោយជាមួយគោលដៅរបស់អ្នក ដោយកាត់បន្ថយទិន្នផលសរុប។ ប្រើសូដ្យូមផូស្វាតជំនួសវិញ។

ការដោះស្រាយបញ្ហា IMAC បរាជ័យ៖ នៅពេលដែលឌីណាមិកខូច

ជួនកាលប្រូតេអ៊ីនគោលដៅរបស់អ្នកបរាជ័យទាំងស្រុងក្នុងការចង។ អ្នកត្រូវតែបែងចែកឱ្យបានលឿនរវាងការបរាជ័យគីមី និងការបរាជ័យស្តេរីក។ ពិនិត្យមើលលំដាប់របស់អ្នកជាមុនសិន។ ស្លាករបស់គាត់អាចត្រូវបានកប់យ៉ាងជ្រៅនៅក្នុងស្នូល 3D នៃប្រូតេអ៊ីន។ កន្លែងចងមិនអាចទៅដល់លោហៈបានទេ។ ជាសំណាងល្អ គីមីវិទ្យា IMAC មិនតម្រូវឱ្យមានប្រូតេអ៊ីនបត់ដើម្បីដំណើរការទេ។ អ្នកអាចប្តូរទាំងស្រុងទៅលក្ខខណ្ឌ denaturing ។ ការបន្ថែមអ៊ុយ 8M ធ្វើអោយប្រូតេអ៊ីនចេញទាំងស្រុង។ វាលាតត្រដាងស្លាកដែលកប់ ស្ដារឡើងវិញនូវសមត្ថភាពចងពេញលេញភ្លាមៗ។

ការ​លុប​មុន​ពេល​លាង​មុខ​បង្ហាញ​ពី​ការ​ធ្វើ​ឱ្យ​ប្រសើរ​លើស​កំណត់។ ប្រសិនបើប្រូតេអ៊ីនរបស់អ្នកលាងចេញមុនជំហានចុងក្រោយ កំហាប់មូលដ្ឋានរបស់អ្នកទំនងជាខ្ពស់ពេក។ ម៉ូលេគុលគូប្រជែងកំពុងផ្លាស់ប្តូរគោលដៅរបស់អ្នកមុនអាយុ។ ជាជម្រើស ពិនិត្យមើល pH សតិបណ្ដោះអាសន្នរបស់អ្នកដោយប្រុងប្រយ័ត្ន។ ថាមវន្តចងសំខាន់នឹងដួលរលំ ប្រសិនបើ pH ធ្លាក់ចុះក្រោម 7.0 ដោយអចេតនា។ កម្រិត pH ទាប បង្កើត​គូ​អាសូត​ឯកោ​សំខាន់។ នៅពេលដែល protonated វាបាត់បង់សមត្ថភាពក្នុងការដំណើរការជាមូលដ្ឋាន Lewis ។ តែងតែផ្ទៀងផ្ទាត់ pH របស់អ្នកបន្ទាប់ពីរំលាយអំបិលទាំងអស់។

គោលការណ៍តិត្ថិភាពបំបែកទេវកថានៃការធ្វើមាត្រដ្ឋានទូទៅ។ ការប្រើប្រាស់ជ័រច្រើនមិនស្មើនឹងលទ្ធផលប្រសើរជាងមុន។ ជាការពិត ជ័រច្រើនហួសប្រមាណជាធម្មតាកាត់បន្ថយភាពបរិសុទ្ធទាំងមូល។ គិតអំពីបាតុភូតរារាំងដូចជាស្រោមដៃកីឡាបេស្បល។ ស្រោមដៃតែមួយអាចកាន់កូនហ្គោលតូចៗជាច្រើនបានយ៉ាងងាយស្រួល។ ទោះ​បី​ជា​យ៉ាង​ណា​វា​អាច​កាន់​បាល់​ទះ​ធំ​មួយ​ប៉ុណ្ណោះ។ ប្រូតេអ៊ីន​ដែល​មាន​ទំហំ​ធំ​រារាំង​កន្លែង​ចង​ជាប់​គ្នា​។ អ្នកត្រូវតែគណនាបរិមាណគ្រែដែលត្រូវការអប្បបរមាឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។ ការប្រមូលផ្តុំម៉ាទ្រីសដោយចេតនាបង្ខំឱ្យគោលដៅដែលមានភាពស្និទ្ធស្នាលខ្ពស់ដើម្បីផ្លាស់ប្តូរភាពមិនបរិសុទ្ធដែលចងខ្សោយខាងរាងកាយ។

ដំណើរការក្រោយការបំប្លែងចេញ៖ ការដក Imidazole ចេញ

តម្លៃអាជីវកម្មនៃការចម្លងរោគដែលនៅសេសសល់គឺលើសពីការបន្សុតដំបូង។ ការប្រមូលផ្តុំគូប្រជែងខ្ពស់ជ្រៀតជ្រែកយ៉ាងសកម្មជាមួយការវិភាគសំខាន់ៗ។ ពួកវាតែងតែបំផ្លាញអេក្រង់គ្រីស្តាល់ដែលងាយរងគ្រោះ។ ពួកគេក៏ធ្វើឱ្យស្មុគស្មាញដល់រូបមន្តព្យាបាលដោយការផ្លាស់ប្តូរ osmolarity ក្នុងតំបន់។ អ្នក​មិន​អាច​ទុក​ឱ្យ​អ្នក​មិន​បាន​ប៉ះ​ពាល់​ដោយ​សាមញ្ញ​ឡើយ។ អ្នកត្រូវតែរៀបចំជំហានដកចេញជាក់លាក់មួយ ដើម្បីធានាថាសកម្មភាពជីវសាស្រ្តនៅតែដដែលសម្រាប់ការធ្វើតេស្តមុខងារ។

ការវាយតម្លៃវិធីសាស្ត្រដកយកចេញស្តង់ដារតម្រូវឱ្យមានពេលវេលាតុល្យភាពប្រឆាំងនឹងការធ្វើមាត្រដ្ឋាន។ ការរំលាយប្រូតេអ៊ីន និងការលាងឈាមតំណាងឱ្យជម្រើសចម្បងពីររបស់អ្នក។ ការលាងឈាមនៅតែមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់សម្រាប់ក្រុមស្រាវជ្រាវតូចៗ។ អ្នកបិទប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងភ្នាសពាក់កណ្តាលដែលអាចជ្រាបចូលបាន ហើយទុកឱ្យការសាយភាយធ្វើការងារ។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ការលាងឈាមត្រូវចំណាយពេលច្រើនម៉ោង។ Desalting columns ប្រើប្រាស់ Size Exclusion Chromatography (SEC)។ ប្រូតេអ៊ីនធំធ្វើដំណើរយ៉ាងលឿនតាមរយៈបរិមាណទទេ។ ម៉ូលេគុលតូចៗជាប់នៅខាងក្នុងអង្កាំ។ SEC ផ្តល់នូវដំណើរការលឿន និងអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបានសម្រាប់ការកំណត់ពេលវេលាផលិតកម្មពាណិជ្ជកម្ម។

សម្រាប់កម្មវិធីដែលមានភាពរសើបខ្លាំង អ្នកអាចប្រើប្រាស់យុទ្ធសាស្ត្រខុសគ្នាទាំងស្រុង។ វិធីសាស្រ្ត elution ដោយគ្មានគូប្រជែង ឆ្លងកាត់ការប្រកួតប្រជែងគីមីទាំងស្រុង។ អ្នករៀបចំបរិយាកាសរាងកាយជំនួសវិញ។

1. ការលាងសម្អាតដំបូង៖ សម្អាតជួរឈរដែលបានផ្ទុកនៅកម្រិត pH នៃ 8.0 ដើម្បីយកកំទេចកំទីដែលមិនជាប់ពាក់ព័ន្ធ។

2. ទម្លាក់​ដំបូង៖ បន្ថយ​សតិបណ្ដោះ​អាសន្ន​ការ​លាង​ដោយ​បង្កើន​ទៅ​កម្រិត pH 7.4។ វាចាប់ផ្តើមធ្វើឱ្យអន្តរកម្មមិនជាក់លាក់ចុះខ្សោយ។

3. ការលាងសម្អាតជ្រៅ៖ ទម្លាក់ pH បន្ថែមទៀតដល់ 6.5 ។ ប្រូតេអ៊ីនដែលផ្ទុកដោយសំណល់ histidine ចៃដន្យនឹងបំបែក និងលាងសម្អាតចេញទាំងស្រុង។

4. ការវាយតម្លៃចុងក្រោយ៖ អនុវត្តសតិបណ្ដោះអាសន្ន elution នៅ pH 5.5 ដល់ 6.0 ។ នេះធ្វើឱ្យស្លាក polyhistidine ប្រូតុង។ ស្លាកបាត់បង់លក្ខណៈសម្បត្តិមូលដ្ឋានរបស់ Lewis ហើយបញ្ចេញយ៉ាងស្អាតដោយគ្មានម៉ូលេគុលគូប្រជែងបន្ថែម។

សេចក្តីសន្និដ្ឋាន

ការធ្វើជាម្ចាស់នៃភាពជោគជ័យរបស់ IMAC ទាមទារឱ្យមានតុល្យភាពរវាង Lewis acid-base chemistry ដ៏ឆ្ងាញ់។ ការត្រួតពិនិត្យជម្រាលភាពជាក់លាក់កំណត់ដោយផ្ទាល់នូវគុណភាពផលិតផលចុងក្រោយរបស់អ្នក។ អ្នកត្រូវតែផ្គូផ្គងធរណីមាត្រជ័រដែលសមស្របទៅនឹងគោលដៅនៃភាពបរិសុទ្ធជាក់លាក់របស់អ្នក។ កុំសន្មតថាកម្លាំងអេឡិចត្រូស្តាតគ្រប់គ្រងជួរឈររបស់អ្នក។ ចាត់ទុកដំណើរការនេះថាជាសមីការការធ្វើត្រាប់តាមរចនាសម្ព័ន្ធប្រកួតប្រជែង។ ការគ្រប់គ្រងបរិស្ថានខ្នាតតូចនេះយ៉ាងត្រឹមត្រូវធានានូវលទ្ធភាពផលិតឡើងវិញដែលអាចធ្វើមាត្រដ្ឋានបាន។

ជំហានបន្ទាប់ដែលអាចធ្វើសកម្មភាពរបស់អ្នកចាប់ផ្តើមនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍ថ្ងៃនេះ។ ជាដំបូង ធ្វើសវនកម្មលើបញ្ហានៃការបន្សុតបច្ចុប្បន្នរបស់អ្នកយ៉ាងជិតស្និទ្ធ។ តើ​អ្នក​កំពុង​ជួប​ប្រទះ​នឹង​សំឡេង​រំខាន​នៅ​ផ្ទៃ​ខាង​ក្រោយ​ខ្ពស់​? វាយតម្លៃឡើងវិញនូវកំហាប់សតិបណ្ដោះអាសន្នការលាងសម្អាតរបស់អ្នកភ្លាមៗ។ ត្រូវប្រាកដថាអ្នកប្រើប្រាស់បរិមាណគ្រែដែលត្រូវការអប្បបរមា ដើម្បីបង្កើនការប្រមូលផ្តុំគ្នាយ៉ាងតឹងរ៉ឹង។ ជាចុងក្រោយ ប្រសិនបើការលេចធ្លាយលោហធាតុបង្កផលប៉ះពាល់ដល់កិច្ចខិតខំប្រឹងប្រែងបង្កើនទំហំរបស់អ្នក សូមប្តូរម៉ាទ្រីសរបស់អ្នកពី IDA ទៅ NTA ភ្លាមៗ។

សំណួរគេសួរញឹកញាប់

សំណួរ៖ ហេតុអ្វីបានជាខ្ញុំមិនអាចប្រើ NaCl (អំបិល) ដើម្បីបន្លំប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាករបស់គាត់ជំនួសឱ្យ imidazole?

ចម្លើយ៖ អំបិលបង្អាក់ចំណងអ៊ីយ៉ុងសាមញ្ញ។ យើងប្រើអំបិលជាចម្បងនៅក្នុង Ion Exchange Chromatography ។ IMAC ពឹងផ្អែកទាំងស្រុងលើសំរបសំរួលចំណង covalent តាមរយៈ Lewis acid-base chemistry។ កំហាប់ខ្ពស់នៃ NaCl មិនអាចបំបែកស្មុគ្រស្មាញដែលមានស្ថេរភាពទាំងនេះប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនោះទេ។ អ្នកត្រូវការការធ្វើត្រាប់តាមរចនាសម្ព័ន្ធដើម្បីប្រកួតប្រជែងសម្រាប់កន្លែងភ្ជាប់ដែកជាក់លាក់។

សំណួរ៖ ហេតុអ្វីបានជាខ្ញុំមិនអាចប្រើដំណោះស្រាយនីកែលដែលមានកំហាប់ខ្ពស់ដើម្បីបន្សាបប្រូតេអ៊ីនរបស់ខ្ញុំ?

ចម្លើយ៖ អ៊ីយ៉ុង Ni2+ ឥតគិតថ្លៃនៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន elution របស់អ្នកមានបន្ទុកវិជ្ជមាន។ នីកែលដែលជាប់គាំងនៅលើជ័ររបស់អ្នកក៏មានបន្ទុកវិជ្ជមានផងដែរ។ ម៉ាទ្រីសថេរវាយលុកអ៊ីយ៉ុងសេរីយ៉ាងខ្លាំងក្លា។ លោហធាតុឥតគិតថ្លៃ ហូរត្រង់ត្រង់ជួររបស់អ្នកដោយមិនផ្លាស់ប្តូរប្រូតេអ៊ីនគោលដៅរបស់អ្នកឡើយ។

សំណួរ៖ តើខ្ញុំយក imidazole ចេញពីជ័រ Ni-NTA របស់ខ្ញុំដោយរបៀបណា សម្រាប់ការរក្សាទុក/បង្កើតឡើងវិញ?

ចម្លើយ៖ ម៉ូលេគុលគូប្រជែងរក្សាភាពស្និទ្ធស្នាលទាបសម្រាប់នីកែល បើប្រៀបធៀបទៅនឹងស្លាក hexahistidine ។ អ្នក​មិន​ត្រូវ​ការ​ថ្នាំ​បំបាត់​ការ​លំបាក​។ ដោយគ្រាន់តែលាងសម្អាតជួរឈរឱ្យបានហ្មត់ចត់ជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្នដែលដំណើរការលើសនោះ ងាយស្រួលផ្លាស់ប្តូរវាចេញ។ អនុវត្តតាមជំហាននេះជាមួយនឹងទឹកចម្រោះ បន្ទាប់មករក្សាទុកជ័រដោយសុវត្ថិភាពក្នុង 20% អេតាណុល។