இமிடாசோல் நிக்கலுடன் எவ்வாறு பிணைக்கிறது

சீரற்ற புரதச் சுத்திகரிப்பு விளைச்சல் பெரும்பாலும் அனுபவமுள்ள ஆய்வக மேலாளர்களைக் கூட விரக்தியடையச் செய்கிறது. பல கீழ்நிலை செயலாக்க பொறியாளர்கள் மோசமான தூய்மை அல்லது எதிர்பாராத இலக்கு இழப்பை தினமும் எதிர்கொள்கின்றனர். அவை பெரும்பாலும் குறிப்பிட்ட ஒருங்கிணைப்பு வேதியியலைப் பொருத்த இடையக செறிவுகளைச் சரிசெய்வதற்குப் பதிலாக பொதுவான நெறிமுறைகளையே நம்பியிருக்கின்றன. அசையாத மெட்டல் அஃபினிட்டி குரோமடோகிராபி (IMAC) முழுமையான துல்லியத்தைக் கோருகிறது. உங்கள் இலக்கு மூலக்கூறின் தனித்துவமான பிணைப்பு இயக்கவியலை நீங்கள் புறக்கணித்தால், கடுமையான பணிப்பாய்வு இடையூறுகள் ஏற்படும். இடையே உள்ள அடிப்படை கட்டமைப்பு உறவை இக்கட்டுரை நிராகரிக்கிறது இமிடாசோல் மற்றும் நிக்கல். நாங்கள் கோட்பாட்டு வழிமுறைகளிலிருந்து நடைமுறை பிசின் தேர்வு அளவுகோல்களுக்கு நேராக மாறுகிறோம். ஹிஸ்-டேக் எலுஷன் புரோட்டோகால்களை மேம்படுத்துவதற்கான ஆதார அடிப்படையிலான கட்டமைப்பை நீங்கள் கண்டுபிடிப்பீர்கள். பொதுவான சுத்திகரிப்பு தோல்விகளை எவ்வாறு திறம்பட சரிசெய்வது என்பதையும் நாங்கள் விவரிக்கிறோம். இந்த அத்தியாவசிய வேதியியலைப் புரிந்துகொள்வது கணிக்க முடியாத சோதனை முடிவுகளை மிகவும் அளவிடக்கூடிய, நம்பகமான கீழ்நிலை செயல்முறைகளாக மாற்றுகிறது.

முக்கிய எடுக்கப்பட்டவை

• கட்டமைப்பு மிமிக்ரி: இமிடாசோல் ஹிஸ்டைடின் குறிச்சொற்களை விட அதிகமாக உள்ளது, ஏனெனில் அதன் ஐந்து-உறுப்பு வளைய அமைப்பு செறிவூட்டப்பட்ட லூயிஸ் தளமாக செயல்படுகிறது, நிக்கல் ஒருங்கிணைப்பு தளங்களில் இலக்கு புரதத்தை நேரடியாக இடமாற்றம் செய்கிறது.

• பிசின் தேர்வு விஷயங்கள்: நிக்கல்-இமிடாசோல் தொடர்புகளின் ஸ்திரத்தன்மை, பயன்படுத்தப்படும் செலேட்டிங் லிகண்டைப் பொறுத்தது (எ.கா. 4-டென்டேட் என்டிஏ 3-டென்டேட் ஐடிஏவை விட உலோகக் கசிவைத் தடுக்கிறது).

• ஒரு கண்ட்ரோல் டயலாக செறிவு: பிணைப்பின் போது இமிடாசோலின் துல்லியமான டியூனிங் (10-25 மி.மீ.) ஹோஸ்ட் புரதக் குறுக்கீட்டை அடக்குகிறது, அதே நேரத்தில் அதிக செறிவுகள் (200-500 மி.எம்.) இலக்கை நீக்குகிறது.

• வேதியியலுக்கு அப்பால்: 'செறிவு விளைவு' (பிசின் தொகுதி மற்றும் புரத நிறை) போன்ற இயற்பியல் காரணிகள் உயர் தூய்மையை அடைவதற்கு இடையக வேதியியலைப் போலவே முக்கியமானவை.

தி மாலிகுலர் மெக்கானிசம்: லூயிஸ் அமிலங்கள், அடிப்படைகள் மற்றும் கட்டமைப்பு மிமிக்ரி

பல தொடக்கநிலையாளர்கள் மின்னியல் ஈர்ப்பு இயக்கிகள் நெடுவரிசை பிணைப்பைக் கருதுகின்றனர். இந்த பிரபலமான கட்டுக்கதை பரவலான நெறிமுறை பிழைகளை ஏற்படுத்துகிறது. உடலியல் pH இல், ஹிஸ்டைடின் பெரும்பாலும் நடுநிலையில் உள்ளது. உண்மையான தொடர்பு முற்றிலும் ஒருங்கிணைந்த கோவலன்ட் பிணைப்புகளை நம்பியுள்ளது. இதை லூயிஸ் அமில-கார வேதியியல் என்கிறோம். இந்த அமைப்பில், அசையாத நிக்கல் எலக்ட்ரான் ஏற்பியாக செயல்படுகிறது. நைட்ரஜன் அணுவில் இருக்கும் ஒற்றை ஜோடி எலக்ட்ரான்கள் அத்தியாவசிய தானமாக செயல்படுகிறது. ஐஎம்ஏசி எலுஷனில் தேர்ச்சி பெற இந்த அயனி அல்லாத பொறிமுறையை நீங்கள் புரிந்து கொள்ள வேண்டும். நீங்கள் கணினியை ஒரு எளிய அயனி-பரிமாற்ற நெடுவரிசையாகக் கருதினால், உங்கள் சுத்திகரிப்பு தோல்வியடையும்.

கட்டமைப்பு மிமிக்ரி போட்டி பிணைப்பின் முக்கிய கொள்கையை உருவாக்குகிறது. மூலக்கூறு வடிவவியலை உன்னிப்பாகப் பாருங்கள். நீக்குவதற்குப் பயன்படுத்தப்படும் செயல்பாட்டு மூலக்கூறு ஹிஸ்டைடின் எச்சத்தின் செயலில் உள்ள பக்கச் சங்கிலியை ஒத்ததாகத் தெரிகிறது. அவர்கள் அதே ஐந்து உறுப்பினர் வளைய அமைப்பைப் பகிர்ந்து கொள்கிறார்கள். இந்த இலவச போட்டியாளரை கணினியில் அறிமுகப்படுத்தும்போது, ​​அது அதே உடல் இடைவெளிகளுக்காக தீவிரமாக போராடுகிறது. நிக்கல் அயனியால் கட்டற்ற வளையம் மற்றும் குறியிடப்பட்ட புரதம் ஆகியவற்றை வேறுபடுத்திப் பார்க்க முடியாது. அவை இரண்டும் ஒரே மாதிரியான எலக்ட்ரான் நன்கொடை முகங்களை உலோக மையத்திற்கு வழங்குகின்றன.

பொறிமுறையானது போட்டி மிமிக்ரியை பெரிதும் நம்பியிருப்பதால், வெற்றிகரமான நீக்குதல் முற்றிலும் எண்கள் விளையாட்டாக மாறும். உங்கள் பிசினில் ஒரு நிலையான எண்ணிக்கையிலான அணுகக்கூடிய நிக்கல் பிணைப்பு தளங்கள் உள்ளன. பாலிஹிஸ்டைடின் குறிச்சொல் பல எச்சங்களின் தீவிர விளைவு காரணமாக வலுவாக பிணைக்கிறது. இருப்பினும், நெடுவரிசையில் வெள்ளம் என்பது கணித நன்மையை புரட்டுகிறது. இலவச ஒரு பெரிய செறிவு இமிடாசோல் சுற்றுச்சூழலை மூழ்கடிக்கிறது. இது அதிகப்படியான மூலக்கூறு இருப்பு மூலம் குறிச்சொல்லை விட அதிகமாக உள்ளது. இந்த வெகுஜன இடப்பெயர்ச்சி இலக்கு புரதத்தை வெளியிடுவதற்கும் நெடுவரிசை வழியாகப் பாய்வதற்கும் கட்டாயப்படுத்துகிறது.

பைண்டிங் கெமிஸ்ட்ரியை ரெசின் தேர்வு அளவுகோலாக மொழிபெயர்த்தல்

செலாட்டர் வடிவவியலை மதிப்பிடுவது உங்கள் இறுதி விளைச்சலை நேரடியாக பாதிக்கிறது. திட ஆதரவு பிசின் நிக்கல் அயனியை பாதுகாப்பாக வைத்திருக்க வேண்டும். நிலையான நைட்ரிலோட்ரியாசெடிக் அமிலம் (NTA) நான்கு முதன்மை ஒருங்கிணைப்பு தளங்களைப் பயன்படுத்துகிறது. இந்த டெட்ராடென்டேட் ஏற்பாடு உலோகத்தைப் பாதுகாப்பாகப் பிடிக்கிறது. இது ஹிஸ்டைடின் குறிச்சொல்லுக்காக சரியாக இரண்டு ஒருங்கிணைப்பு தளங்களை திறந்து வைக்கிறது. பழைய இமினோடியாசெடிக் அமிலம் (IDA) மூன்று ஒருங்கிணைப்பு தளங்களை மட்டுமே பயன்படுத்துகிறது. ஐடிஏ உலோகத்தை மிகவும் தளர்வாக வைத்திருக்கிறது. அதிக செறிவூட்டப்பட்ட எலுஷன் கட்டங்களில் தேவையற்ற நிக்கல் கசிவை NTA கட்டுப்படுத்துகிறது. உலோகக் கசிவைக் குறைப்பது அளவிடப்பட்ட மருந்து உற்பத்திக்கு ஒரு முக்கியமான இணக்கக் காரணியாக உள்ளது.

ஐடிஏ மற்றும் என்டிஏ ரெசின்களின் கட்டமைப்பு இயக்கவியலை ஒப்பிடும் சுருக்க விளக்கப்படம் கீழே உள்ளது:

ரெசின் செலேட்டர்	பயன்படுத்தப்படும் ஒருங்கிணைப்பு தளங்கள்	புரதத்திற்கான தளங்களைத் திறக்கவும்	உலோக கசிவு ஆபத்து
ஐடிஏ (இமினோடியாசெடிக் அமிலம்)	3 (முக்கோணம்)	3	உயர் (குறிப்பாக உயர் எலுஷன் மோலாரிட்டிகளில்)
NTA (நைட்ரிலோட்ரியாசெடிக் அமிலம்)	4 (டெட்ராடெண்டேட்)	2	குறைந்த (மாற்று உலோகங்களை இறுக்கமாக பிணைக்கிறது)

சரியான மாற்றம் உலோகத்தைத் தேர்ந்தெடுப்பது உங்கள் அடிப்படைத் தன்மையை மாற்றுகிறது. உங்கள் குறிப்பிட்ட கீழ்நிலை இலக்குகளுடன் உலோகத்தை பொருத்த வேண்டும். நிக்கல் உயர் திறனுக்கான தொழில் தரத்தை குறிக்கிறது. இது பொது நோக்கத்திற்கான பிடிப்பை அழகாக கையாளுகிறது. கோபால்ட் ஒட்டுமொத்தமாக பலவீனமான பிணைப்பு உறவை வழங்குகிறது. கோபால்ட்டிலிருந்து உங்கள் இலக்கைத் தவிர்க்க உங்களுக்கு மிகவும் குறைவான போட்டியாளர் மூலக்கூறு தேவைப்படுகிறது. இருப்பினும், கோபால்ட் பின்னணி ஹோஸ்ட் புரதங்களை திறம்பட நிராகரிப்பதன் மூலம் மிக உயர்ந்த தூய்மையை வழங்குகிறது. தாமிரம் அதிகபட்ச பிணைப்பு வலிமையை வழங்குகிறது, ஆனால் குறைந்த விவரக்குறிப்பை வழங்குகிறது. ELISA பூச்சு போன்ற எளிய செறிவூட்டல் பணிகளுக்கு நீங்கள் தாமிரத்தை ஒதுக்க வேண்டும்.

உலோக அயன்	பிணைப்பு தொடர்பு	தனித்தன்மை	சிறந்த பயன்பாட்டு வழக்கு
நிக்கல் (Ni2+)	உயர்	மிதமான	நிலையான புரத உற்பத்தி மற்றும் அதிக மகசூல் பிடிப்பு.
கோபால்ட் (Co2+)	மிதமான	உயர்	குறைந்த பின்னணி இரைச்சலைக் கோரும் உயர் தூய்மை பயன்பாடுகள்.
தாமிரம் (Cu2+)	மிக உயர்ந்தது	குறைந்த	எளிய புல்-டவுன் மதிப்பீடுகள் மற்றும் அடிப்படை செறிவூட்டல்.

தொகுதி அளவீடுகள் தொடர்பான விற்பனையாளர் வெளிப்படைத்தன்மைக்கு உங்கள் கடுமையான கவனம் தேவை. வாங்குபவர்கள் பெரும்பாலும் உடல் இடைநீக்க விவரங்களை புறக்கணிக்கிறார்கள். வணிகப் பிசின்கள் எப்போதும் 50% அக்வஸ் சஸ்பென்ஷன்களாக அனுப்பப்படுகின்றன. அவை பொதுவாக எத்தனால் பாதுகாக்கும் கரைசலில் மிதக்கின்றன. ஒரு மில்லிலிட்டர் 'படுக்கையின் அளவு' உண்மையில் இரண்டு மில்லிலிட்டர்கள் இயற்பியல் குழம்பு பைப்பட் செய்ய வேண்டும். இந்த விகிதத்தைக் கணக்கிடத் தவறினால், உங்கள் கோட்பாட்டு பிணைப்புத் திறனை உடனடியாக பாதியாகக் குறைக்கிறது. இந்த கணக்கீடு கொள்முதல் மற்றும் செயல்முறை அளவிடுதலுக்கு முற்றிலும் முக்கியமானது என்பதை நிரூபிக்கிறது.

நெறிமுறை உகப்பாக்கம்: இமிடாசோல் கிரேடியன்ட் பொறியியல்

பிணைப்பு மற்றும் கழுவும் கட்டங்களின் போது துல்லியமான கட்டுப்பாடு சிறந்தவற்றிலிருந்து நல்ல சுத்திகரிப்புகளை பிரிக்கிறது. ஆரம்ப ஏற்றுதல் கட்டத்தில் நீங்கள் 10 முதல் 50 மிமீ வரை குறைந்த அளவுகளை அறிமுகப்படுத்த வேண்டும். இந்த அடித்தள அடுக்கு பலவீனமான பிணைப்பு தளங்களை தீவிரமாக ஆக்கிரமிக்கிறது. எண்டோஜெனஸ் ஹோஸ்ட் புரதங்கள் பெரும்பாலும் சிதறிய ஹிஸ்டைடின் திட்டுகளைக் கொண்டிருக்கின்றன. போவின் சீரம் அல்புமின் (பிஎஸ்ஏ) மற்றும் இம்யூனோகுளோபுலின்கள் சரிபார்க்கப்படாமல் விடப்பட்டால் பிணைக்கப்படாது. குறைந்த அடித்தள செறிவு ஒரு இரசாயன பவுன்சராக செயல்படுகிறது. இந்த ஏமாற்றமளிக்கும் அசுத்தங்கள் மேட்ரிக்ஸில் எப்போதும் இணைவதை இது தீவிரமாக தடுக்கிறது.

நீக்குதல் கட்டம் செறிவு இயக்கவியலில் ஒரு பெரிய மாற்றத்தைக் கோருகிறது. வளாகத்தை உடைக்க பொதுவாக 200 முதல் 500 மிமீ வரை தேவைப்படும். இந்த ஆக்கிரமிப்பு வாசல் உள்ளூர் சூழலை முழுவதுமாக வெள்ளத்தில் மூழ்கடிக்கிறது. பாலிஹிஸ்டிடின் குறிச்சொல் மில்லியன் கணக்கான போட்டியிடும் மூலக்கூறுகளுக்கு எதிராக அதன் பிடியை பராமரிக்க முடியாது. இந்த செறிவை நீங்கள் ஒரு திடீர் படி-எழுப்பு அல்லது நேரியல் சாய்வாகப் பயன்படுத்தலாம். படி நீக்குதல்கள் கூர்மையான உச்சங்களை உருவாக்குகின்றன, ஆனால் சில நேரங்களில் அசுத்தங்களை இழுத்துச் செல்கின்றன. லீனியர் கிரேடியன்ட்கள் நெருக்கமாக தொடர்புடைய மல்டிமெரிக் மாறுபாடுகளைப் பிரிக்கும்போது சிறந்த உச்ச தெளிவுத்திறனை வழங்குகின்றன.

வேதியியல் பொருந்தக்கூடிய கட்டுப்பாடுகள் உங்கள் இடையக உருவாக்கத்தை பெரிதும் ஆணையிடுகின்றன. சில பொதுவான சேர்க்கைகள் நுட்பமான ஒருங்கிணைப்பு சூழலை முற்றிலும் அழிக்கின்றன. ஏற்றுவதற்கு முன் உங்கள் லைசிஸ் பஃபர்களை முழுமையாகத் தணிக்கை செய்ய வேண்டும்.

• குறைக்கும் முகவர்கள்: Dithiothreitol (DTT) ஐ 5 mM க்கு கீழே வைத்திருங்கள். அதிக அளவு உலோக அயனியை தீவிரமாக குறைக்கிறது. பிசின் அசிங்கமான பழுப்பு நிறமாக மாறுவதை நீங்கள் காண்பீர்கள்.

• வலுவான செலேட்டர்கள்: EDTAவை 1 mMக்குக் கீழே வைத்திருங்கள். EDTA ஒரு ஹெக்ஸாடென்டேட் செலட்டராக செயல்படுகிறது. இது NTA மேட்ரிக்ஸில் இருந்து உலோகத்தை நேரடியாக நீக்குகிறது. பிசின் அப்பட்டமான வெள்ளை நிறமாக மாறும்.

• முதன்மை அமீன்கள்: முடிந்தால் ட்ரிஸ் இடையகத்தைத் தவிர்க்கவும். அதிக மொலாரிட்டி டிரிஸ் உங்கள் இலக்குடன் பலவீனமாக தொடர்பு கொள்ளலாம், ஒட்டுமொத்த விளைச்சலைக் குறைக்கும். அதற்கு பதிலாக சோடியம் பாஸ்பேட் பயன்படுத்தவும்.

ஐஎம்ஏசி தோல்விகளை சரிசெய்தல்: இயக்கவியல் உடைக்கும்போது

சில நேரங்களில் உங்கள் இலக்கு புரதம் முழுமையாக பிணைக்கத் தவறிவிடும். இரசாயன தோல்விகள் மற்றும் ஸ்டெரிக் தோல்விகளை நீங்கள் விரைவாக வேறுபடுத்த வேண்டும். முதலில் உங்கள் வரிசையைச் சரிபார்க்கவும். அவரது குறிச்சொல் புரதத்தின் 3D மடிந்த மையத்தில் ஆழமாக புதைக்கப்படலாம். பிணைப்பு தளங்கள் வெறுமனே உலோகத்தை அடைய முடியாது. அதிர்ஷ்டவசமாக, ஐஎம்ஏசி வேதியியல் செயல்பட மடிந்த புரதம் தேவையில்லை. நீங்கள் முற்றிலும் தடைசெய்யும் நிலைமைகளுக்கு மாறலாம். 8M யூரியாவைச் சேர்ப்பதால் புரதம் முழுவதுமாக அவிழ்கிறது. இது புதைக்கப்பட்ட குறியை வெளிப்படுத்துகிறது, முழு பிணைப்பு திறனை உடனடியாக மீட்டெடுக்கிறது.

கழுவும் படிகளின் போது முன்கூட்டிய எலுஷன் அதிகப்படியான தேர்வுமுறையைக் குறிக்கிறது. இறுதி கட்டத்திற்கு முன் உங்கள் புரதம் வெளியேறினால், உங்கள் அடித்தள செறிவு அதிகமாக இருக்கும். போட்டியாளர் மூலக்கூறு உங்கள் இலக்கை முன்கூட்டியே இடமாற்றம் செய்கிறது. மாற்றாக, உங்கள் தாங்கல் pH ஐ கவனமாக சரிபார்க்கவும். கவனக்குறைவாக pH 7.0க்குக் கீழே குறைந்தால் முக்கியமான பிணைப்பு இயக்கவியல் சரிந்துவிடும். குறைந்த pH ஆனது அத்தியாவசிய நைட்ரஜன் தனி ஜோடியை புரோட்டானேட் செய்கிறது. புரோட்டானேட் செய்யப்பட்டவுடன், அது லூயிஸ் தளமாக செயல்படும் திறனை இழக்கிறது. அனைத்து உப்புகளையும் கரைத்த பிறகு உங்கள் pH ஐ எப்போதும் சரிபார்க்கவும்.

செறிவூட்டல் கொள்கை ஒரு பொதுவான அளவிடுதல் கட்டுக்கதையை சிதைக்கிறது. அதிக பிசின் பயன்படுத்துவது சிறந்த முடிவுகளை சமமாக இல்லை. உண்மையில், அதிகப்படியான பிசின் பொதுவாக ஒட்டுமொத்த தூய்மையைக் குறைக்கிறது. பேஸ்பால் கையுறை போன்ற ஸ்டெரிக் தடை நிகழ்வை நினைத்துப் பாருங்கள். ஒரு கையுறை பல சிறிய கோல்ஃப் பந்துகளை எளிதாக வைத்திருக்கும். இருப்பினும், இது ஒரு பெரிய வாலிபால் மட்டுமே நடத்த முடியும். பெரிதாக்கப்பட்ட புரதங்கள் அருகில் உள்ள பிணைப்பு தளங்களை உடல் ரீதியாக தடுக்கின்றன. தேவையான குறைந்தபட்ச படுக்கை அளவை நீங்கள் துல்லியமாக கணக்கிட வேண்டும். மேட்ரிக்ஸை வேண்டுமென்றே கூட்டுவது பலவீனமான பிணைப்பு அசுத்தங்களை உடல் ரீதியாக இடமாற்றம் செய்ய உயர்-தொடர்பு இலக்குகளை கட்டாயப்படுத்துகிறது.

பிந்தைய நீக்குதல் செயலாக்கம்: கீழ்நிலை இமிடாசோல் அகற்றுதல்

எஞ்சிய மாசுபாட்டின் வணிகச் செலவு ஆரம்ப சுத்திகரிப்புக்கு அப்பால் நீண்டுள்ளது. அதிக போட்டியாளர் செறிவுகள் முக்கியமான கீழ்நிலை மதிப்பீடுகளில் தீவிரமாக தலையிடுகின்றன. அவை வழக்கமாக உணர்திறன் படிகமயமாக்கல் திரைகளை அழிக்கின்றன. அவை உள்ளூர் ஆஸ்மோலாரிட்டியை மாற்றுவதன் மூலம் சிகிச்சை சூத்திரங்களை சிக்கலாக்குகின்றன. எலுவேட்டை அப்படியே விட்டுவிட முடியாது. செயல்பாட்டு சோதனைக்காக உயிரியல் செயல்பாடு அப்படியே இருப்பதை உறுதிசெய்ய, நீங்கள் ஒரு பிரத்யேக நீக்கம் படியை வடிவமைக்க வேண்டும்.

நிலையான அகற்றும் முறைகளை மதிப்பிடுவதற்கு, அளவிடுதலுக்கு எதிராக நேரத்தை சமநிலைப்படுத்த வேண்டும். புரோட்டீன் உப்பு நீக்கம் மற்றும் டயாலிசிஸ் உங்கள் இரண்டு முதன்மை விருப்பங்களைக் குறிக்கின்றன. சிறிய ஆராய்ச்சித் தொகுதிகளுக்கு டயாலிசிஸ் மிகவும் செலவு குறைந்ததாகும். நீங்கள் புரதத்தை அரை-ஊடுருவக்கூடிய மென்படலத்தில் அடைத்து, பரவலைச் செய்ய அனுமதிக்கவும். இருப்பினும், டயாலிசிஸ் பல மணிநேரம் ஆகும். டீசால்டிங் நெடுவரிசைகள் அளவு விலக்கு குரோமடோகிராபி (SEC). பெரிய புரதங்கள் வெற்றிடத்தின் வழியாக விரைவாகப் பயணிக்கின்றன. நுண்ணிய மணிகளுக்குள் சிறிய மூலக்கூறுகள் சிக்கிக் கொள்கின்றன. வணிக உற்பத்தி காலக்கெடுவுக்கான விரைவான, அளவிடக்கூடிய செயல்திறனை SEC வழங்குகிறது.

அதிக உணர்திறன் கொண்ட பயன்பாடுகளுக்கு, நீங்கள் முற்றிலும் மாறுபட்ட உத்தியைப் பயன்படுத்தலாம். போட்டியாளர் இல்லாத நீக்குதல் முறை இரசாயன போட்டியை முழுவதுமாக கடந்து செல்கிறது. அதற்கு பதிலாக நீங்கள் உடல் சூழலை கையாளுகிறீர்கள்.

1. ஆரம்ப கழுவுதல்: இணைக்கப்படாத குப்பைகளை அகற்ற, 8.0 நிலையான pH இல் ஏற்றப்பட்ட நெடுவரிசையை சுத்தம் செய்யவும்.

2. முதல் துளி: வாஷ் பஃபரை pH 7.4க்கு படிப்படியாகக் குறைக்கவும். இது குறிப்பிட்ட அல்லாத தொடர்புகளை பலவீனப்படுத்தத் தொடங்குகிறது.

3. டீப் வாஷ்: pH ஐ மேலும் 6.5க்கு குறைக்கவும். சீரற்ற ஹிஸ்டைடின் எச்சங்களைக் கொண்ட புரவலன் புரதங்கள் பிரிந்து முற்றிலும் கழுவப்படும்.

4. இறுதி நீக்கம்: pH 5.5 முதல் 6.0 வரை எலுஷன் பஃப்பரைப் பயன்படுத்தவும். இது பாலிஹிஸ்டிடின் குறியை புரோட்டானேட் செய்கிறது. குறிச்சொல் அதன் லூயிஸ் அடிப்படை பண்புகளை இழக்கிறது மற்றும் கூடுதல் போட்டியாளர் மூலக்கூறுகள் இல்லாமல் சுத்தமாக வெளியிடுகிறது.

முடிவுரை

IMAC வெற்றியில் தேர்ச்சி பெறுவதற்கு மென்மையான லூயிஸ் அமில-அடிப்படை வேதியியலை சமநிலைப்படுத்த வேண்டும். துல்லியமான சாய்வு கட்டுப்பாடு உங்கள் இறுதி தயாரிப்பு தரத்தை நேரடியாக ஆணையிடுகிறது. உங்கள் குறிப்பிட்ட தூய்மை இலக்குகளுடன் பொருத்தமான பிசின் வடிவவியலைப் பொருத்த வேண்டும். மின்னியல் சக்திகள் உங்கள் நெடுவரிசையைக் கட்டுப்படுத்துவதாக ஒருபோதும் கருத வேண்டாம். செயல்முறையை ஒரு போட்டி கட்டமைப்பு மிமிக்ரி சமன்பாடாகக் கருதுங்கள். இந்த நுண்ணிய சூழலை சரியாகக் கட்டுப்படுத்துவது அளவிடக்கூடிய மறுஉற்பத்திக்கு உத்தரவாதம் அளிக்கிறது.

உங்களின் அடுத்தகட்ட நடவடிக்கைகள் இன்று ஆய்வகத்தில் தொடங்கும். முதலில், உங்கள் தற்போதைய சுத்திகரிப்பு தடைகளை நெருக்கமாக தணிக்கை செய்யுங்கள். நீங்கள் அதிக பின்னணி இரைச்சலை அனுபவிக்கிறீர்களா? உங்கள் வாஷ் பஃபர் செறிவுகளை உடனடியாக மறு மதிப்பீடு செய்யுங்கள். ஸ்டெரிக் கூட்டத்தை அதிகரிக்க தேவையான குறைந்தபட்ச படுக்கை அளவைப் பயன்படுத்துவதை உறுதிசெய்யவும். இறுதியாக, மெட்டல் லீச்சிங் உங்களின் ஸ்கேல்-அப் முயற்சிகளை பாதித்தால், உங்கள் மேட்ரிக்ஸை IDA இலிருந்து NTA க்கு உடனடியாக மாற்றவும்.

அடிக்கடி கேட்கப்படும் கேள்விகள்

கே: இமிடாசோலுக்குப் பதிலாக அவரது-குறியிடப்பட்ட புரதங்களை நீக்குவதற்கு நான் ஏன் NaCl (உப்பு) ஐப் பயன்படுத்த முடியாது?

ப: உப்பு எளிய அயனி பிணைப்புகளை சீர்குலைக்கிறது. அயன் எக்ஸ்சேஞ்ச் குரோமடோகிராஃபியில் நாம் உப்பை முதன்மையாகப் பயன்படுத்துகிறோம். IMAC லூயிஸ் அமில-அடிப்படை வேதியியலின் மூலம் ஒருங்கிணைந்த கோவலன்ட் பிணைப்புகளை முழுமையாக நம்பியுள்ளது. NaCl இன் உயர் செறிவுகள் இந்த நிலையான ஒருங்கிணைப்பு வளாகங்களை திறம்பட உடைக்க முடியாது. குறிப்பிட்ட உலோகப் பிணைப்புத் தளங்களுக்குப் போட்டியிட, உங்களுக்கு ஒரு கட்டமைப்பு பிரதிபலிப்பு தேவை.

கே: எனது புரதத்தை குறைக்க அதிக செறிவு கொண்ட நிக்கல் கரைசலை நான் ஏன் பயன்படுத்த முடியாது?

ப: உங்கள் எலுஷன் பஃபரில் உள்ள இலவச Ni2+ அயனிகள் நேர்மறை மின்னூட்டத்தைக் கொண்டுள்ளன. உங்கள் பிசினில் தங்கியிருக்கும் அசையாத நிக்கல் நேர்மறை கட்டணத்தையும் கொண்டுள்ளது. நிலையான அணி இலவச அயனிகளை ஆக்ரோஷமாக விரட்டுகிறது. இலவச உலோகம் உங்கள் இலக்கு புரதத்தை இடமாற்றம் செய்யாமல் உங்கள் நெடுவரிசை வழியாக நேராக பாய்கிறது.

கே: சேமிப்பு/மீளுருவாக்கம் செய்ய எனது Ni-NTA பிசினிலிருந்து இமிடாசோலை எவ்வாறு அகற்றுவது?

ப: ஹெக்ஸாஹிஸ்டிடின் குறிச்சொல்லுடன் ஒப்பிடும்போது போட்டியாளர் மூலக்கூறு நிக்கலுடன் ஒப்பீட்டளவில் குறைந்த தொடர்பைப் பராமரிக்கிறது. உங்களுக்கு கடுமையான அகற்றும் முகவர்கள் தேவையில்லை. அதிகப்படியான இயங்கும் பஃபரைக் கொண்டு நெடுவரிசையை நன்றாகக் கழுவினால், அதை எளிதில் இடமாற்றம் செய்யலாம். காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் இந்த படிநிலையைப் பின்பற்றவும், பின்னர் பிசினை 20% எத்தனாலில் பாதுகாப்பாக சேமிக்கவும்.