ເຈົ້າຢູ່ທີ່ນີ້: ບ້ານ » ບລັອກ » ຂ່າວອຸດສາຫະກໍາ » Imidazole ຜູກມັດກັບ Nickel ແນວໃດ

Imidazole ຜູກມັດກັບ nickel ແນວໃດ

Views: 0 Author: Site Editor ເວລາເຜີຍແຜ່: 2026-04-17 ຕົ້ນກໍາເນີດ: ເວັບໄຊ

ສອບຖາມ

ຜົນຜະລິດການຊໍາລະລ້າງທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ສອດຄ່ອງມັກຈະເຮັດໃຫ້ຜູ້ບໍລິຫານຫ້ອງທົດລອງມີຄວາມຜິດຫວັງ. ວິສະວະກອນການປຸງແຕ່ງທາງລຸ່ມຫຼາຍຄົນປະເຊີນກັບຄວາມບໍລິສຸດທີ່ບໍ່ດີຫຼືການສູນເສຍເປົ້າຫມາຍທີ່ບໍ່ຄາດຄິດປະຈໍາວັນ. ພວກມັນມັກຈະອີງໃສ່ໂປຣໂຕຄອນທົ່ວໄປຫຼາຍກວ່າການປັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງບັຟເຟີເພື່ອໃຫ້ກົງກັບເຄມີການປະສານງານສະເພາະ. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) ຕ້ອງການຄວາມຊັດເຈນຢ່າງແທ້ຈິງ. ຖ້າທ່ານບໍ່ສົນໃຈກັບນະໂຍບາຍດ້ານການຜູກມັດທີ່ເປັນເອກະລັກຂອງໂມເລກຸນເປົ້າຫມາຍຂອງທ່ານ, ທ່ານມີຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການຂັດຂວາງການເຮັດວຽກທີ່ຮ້າຍແຮງ. ບົດຄວາມນີ້ demystifies ການພົວພັນໂຄງສ້າງພື້ນຖານລະຫວ່າງ imidazole ແລະ nickel. ພວກເຮົາຫັນປ່ຽນຢ່າງຄ່ອງແຄ້ວຈາກກົນໄກທາງທິດສະດີໄປຫາມາດຖານການຄັດເລືອກຢາງທີ່ໃຊ້ໄດ້ຢ່າງສະດວກ. ທ່ານຈະຄົ້ນພົບໂຄງຮ່າງການທີ່ອີງໃສ່ຫຼັກຖານສໍາລັບການເພີ່ມປະສິດທິພາບໂປໂຕຄອນ elution-tag ຂອງລາວ. ພວກເຮົາຍັງກວມເອົາວິທີການແກ້ໄຂບັນຫາການຊໍາລະລ້າງທົ່ວໄປຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. ຄວາມເຂົ້າໃຈທາງເຄມີທີ່ສໍາຄັນນີ້ປ່ຽນຜົນການທົດລອງທີ່ບໍ່ສາມາດຄາດເດົາໄດ້ໄປສູ່ຂະບວນການທາງລຸ່ມທີ່ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ສູງ, ເຊື່ອຖືໄດ້.

Key Takeaways

Structural Mimicry: Imidazole outcompetes histidine tags ເນື່ອງຈາກວ່າໂຄງສ້າງວົງແຫວນຫ້າສະມາຊິກຂອງມັນເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນຖານ Lewis ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ, ຍ້າຍທາດໂປຼຕີນເປົ້າຫມາຍໂດຍກົງຢູ່ທີ່ບ່ອນປະສານງານຂອງ nickel.
ເລື່ອງການຄັດເລືອກຂອງ Resin: ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງປະຕິສໍາພັນ nickel-imidazole ແມ່ນຂຶ້ນກັບຫຼາຍຂອງ chelating ligand ທີ່ໃຊ້ (ເຊັ່ນ: 4-dentate NTA ປ້ອງກັນການຮົ່ວໄຫຼຂອງໂລຫະດີກວ່າ 3-dentate IDA).
ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນເປັນແຖບຄວບຄຸມ: ການປັບຄວາມຊັດເຈນຂອງ imidazole ໃນລະຫວ່າງການຜູກມັດ (10–25 mM) ສະກັດກັ້ນການແຊກແຊງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກເຈົ້າພາບ, ໃນຂະນະທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງ (200-500 mM) ຂັບໄລ່ເປົ້າຫມາຍ.
ນອກເຫນືອຈາກເຄມີສາດ: ປັດໃຈທາງກາຍະພາບເຊັ່ນ: 'ຜົນກະທົບຄວາມອີ່ມຕົວ' (ປະລິມານຢາງທຽບກັບມວນທາດໂປຼຕີນ) ແມ່ນສໍາຄັນເທົ່າກັບເຄມີບໍາບັດສໍາລັບການບັນລຸຄວາມບໍລິສຸດສູງ.

ກົນໄກໂມເລກຸນ: Lewis Acids, Bases, ແລະໂຄງສ້າງ Mimicry

ຜູ້ເລີ່ມຕົ້ນຈໍານວນຫຼາຍສົມມຸດວ່າຄວາມດຶ່ງດູດໄຟຟ້າສະຖິດເຮັດໃຫ້ການຜູກມັດຖັນ. ນິທານທີ່ເປັນທີ່ນິຍົມນີ້ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມຜິດພາດຂອງໂປຣໂຕຄໍຢ່າງແຜ່ຫຼາຍ. ຢູ່ທີ່ pH ທາງດ້ານຮ່າງກາຍ, histidine ຍັງຄົງເປັນກາງ. ການໂຕ້ຕອບທີ່ແທ້ຈິງແມ່ນອີງໃສ່ການປະສານງານພັນທະບັດ covalent. ພວກເຮົາເອີ້ນນີ້ວ່າ Lewis acid-base chemistry. ໃນລະບົບນີ້, nickel immobilized ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນຕົວຮັບເອເລັກໂຕຣນິກ. ຄູ່ຂອງອິເລັກຕອນດຽວຢູ່ໃນອະຕອມໄນໂຕຣເຈນເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນຜູ້ໃຫ້ທຶນທີ່ຈໍາເປັນ. ທ່ານຕ້ອງເຂົ້າໃຈກົນໄກທີ່ບໍ່ແມ່ນ ionic ນີ້ເພື່ອແມ່ບົດ elution IMAC. ຖ້າທ່ານປະຕິບັດຕໍ່ລະບົບຄືກັບຖັນການແລກປ່ຽນ ion-exchange ງ່າຍໆ, ການເຮັດຄວາມສະອາດຂອງທ່ານຈະລົ້ມເຫລວ.

mimicry ໂຄງສ້າງປະກອບເປັນຫຼັກການຫຼັກຂອງການຜູກມັດການແຂ່ງຂັນ. ເບິ່ງຢ່າງໃກ້ຊິດຢູ່ໃນເລຂາຄະນິດໂມເລກຸນ. ໂມເລກຸນທີ່ເປັນປະໂຫຍດທີ່ໃຊ້ສໍາລັບ elution ມີລັກສະນະຄ້າຍຄືກັນກັບຕ່ອງໂສ້ດ້ານຂ້າງທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວຂອງ residue histidine. ພວກເຂົາເຈົ້າແບ່ງປັນໂຄງສ້າງວົງແຫວນຫ້າສະມາຊິກດຽວກັນ. ໃນເວລາທີ່ທ່ານແນະນໍາຄູ່ແຂ່ງຟຣີນີ້ເຂົ້າໄປໃນລະບົບ, ມັນຕໍ່ສູ້ຢ່າງຈິງຈັງສໍາລັບສະຖານທີ່ທາງດ້ານຮ່າງກາຍດຽວກັນ. nickel ion ບໍ່ສາມາດຈໍາແນກລະຫວ່າງວົງແຫວນຟຣີແລະທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກ tagged. ເຂົາເຈົ້າທັງສອງສະເໜີໃບໜ້າບໍລິຈາກເອເລັກໂຕຣນິກທີ່ຄືກັນກັບສູນໂລຫະ.

ເນື່ອງຈາກວ່າກົນໄກແມ່ນອີງໃສ່ການ mimicry ການແຂ່ງຂັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, elution ສົບຜົນສໍາເລັດກາຍເປັນເກມຕົວເລກຢ່າງດຽວ. ທ່ານມີຈໍານວນຄົງທີ່ຂອງສະຖານທີ່ຜູກມັດ nickel ທີ່ສາມາດເຂົ້າເຖິງໄດ້ຢູ່ໃນຢາງຂອງທ່ານ. ແທັກ polyhistidine ຜູກມັດຢ່າງແຂງແຮງເນື່ອງຈາກຜົນກະທົບຂອງສານຕົກຄ້າງຫຼາຍ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ນ້ໍາຖ້ວມຄໍລໍາ flips ປະໂຫຍດທາງຄະນິດສາດ. ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນອັນໃຫຍ່ຫຼວງຂອງຟຣີ imidazole overwhelms ສະພາບແວດລ້ອມ. ມັນເອົາຊະນະແທັກໄດ້ໂດຍການມີໂມເລກຸນທີ່ລົ້ນເຫຼືອ. ການຍ້າຍມະຫາຊົນນີ້ບັງຄັບໃຫ້ທາດໂປຼຕີນຈາກເປົ້າຫມາຍທີ່ຈະປ່ອຍແລະໄຫຼຜ່ານຖັນ.

ການແປພາສາເຄມີມັດເຂົ້າໄປໃນເງື່ອນໄຂການຄັດເລືອກຢາງ

ການປະເມີນເລຂາຄະນິດ chelator ມີຜົນກະທົບໂດຍກົງຕໍ່ຜົນຜະລິດສຸດທ້າຍຂອງທ່ານ. ຢາງຮອງພື້ນແຂງຕ້ອງຖື nickel ion ຢ່າງປອດໄພ. ອາຊິດ Nitrilotriacetic ມາດຕະຖານ (NTA) ນໍາໃຊ້ສີ່ສະຖານທີ່ປະສານງານຕົ້ນຕໍ. ການຈັດວາງ tetradentate ນີ້ດັກໂລຫະຢ່າງປອດໄພ. ມັນເຮັດໃຫ້ສະຖານທີ່ປະສານງານສອງບ່ອນເປີດສໍາລັບແທັກ histidine. ອາຊິດ Iminodiacetic ເກົ່າ (IDA) ໃຊ້ພຽງແຕ່ສາມບ່ອນປະສານງານ. IDA ຖືໂລຫະຫຼາຍວ່າງຫຼາຍ. NTA ຈຳກັດການຮົ່ວໄຫຼຂອງ nickel ທີ່ບໍ່ຕ້ອງການໃນລະຫວ່າງໄລຍະ elution ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງ. ການຫຼຸດຜ່ອນການຮົ່ວໄຫຼຂອງໂລຫະຍັງຄົງເປັນປັດໃຈປະຕິບັດຕາມທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບການຜະລິດຢາທີ່ມີຂະຫນາດ.

ຂ້າງລຸ່ມນີ້ແມ່ນຕາຕະລາງສະຫຼຸບປຽບທຽບນະໂຍບາຍດ້ານໂຄງສ້າງຂອງ IDA ແລະ NTA resins:

Chelator ຢາງ	ສະຖານທີ່ປະສານງານທີ່ໃຊ້	ເປີດສະຖານທີ່ສໍາລັບທາດໂປຼຕີນ	ຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການຮົ່ວໄຫຼຂອງໂລຫະ
IDA (ອາຊິດ Iminodiacetic)	3 (ສາມຫຼ່ຽມ)	3	ສູງ (ໂດຍສະເພາະໃນ molarity elution ສູງ)
NTA (ອາຊິດ Nitrilotriacetic)	4 (Tetradentate)	2	ຕ່ຳ (ມັດໂລຫະປ່ຽນສະຫຼັບໃຫ້ແໜ້ນ)

ການເລືອກໂລຫະການປ່ຽນແປງທີ່ຖືກຕ້ອງປ່ຽນຄວາມສະເພາະຂອງພື້ນຖານຂອງທ່ານ. ທ່ານຕ້ອງຈັບຄູ່ໂລຫະກັບເປົ້າຫມາຍລົງລຸ່ມສະເພາະຂອງທ່ານ. Nickel ເປັນຕົວແທນຂອງມາດຕະຖານອຸດສາຫະກໍາສໍາລັບຄວາມສາມາດສູງ. ມັນຈັດການການຖ່າຍຮູບແບບທົ່ວໄປຢ່າງສວຍງາມ. Cobalt ສະຫນອງການຜູກມັດທີ່ອ່ອນແອໂດຍລວມ. ທ່ານຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີໂມເລກຸນຄູ່ແຂ່ງຫນ້ອຍທີ່ສຸດເພື່ອ elute ເປົ້າຫມາຍຂອງທ່ານຈາກ cobalt. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, cobalt ສະຫນອງຄວາມບໍລິສຸດທີ່ດີກວ່າຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍການປະຕິເສດທາດໂປຼຕີນຈາກເຈົ້າພາບພື້ນຫລັງຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. ທອງແດງໃຫ້ຄວາມເຂັ້ມແຂງຜູກມັດສູງສຸດແຕ່ສະຫນອງຄວາມສະເພາະຕ່ໍາສຸດ. ທ່ານຄວນສະຫງວນທອງແດງສໍາລັບວຽກງານການເສີມສ້າງແບບງ່າຍດາຍເຊັ່ນການເຄືອບ ELISA.

ທາດໄອອອນ	ຄວາມຜູກພັນທີ່ຜູກມັດ	ສະເພາະ	ກໍລະນີການນໍາໃຊ້ທີ່ດີທີ່ສຸດ
Nickel (Ni2+)	ສູງ	ປານກາງ	ການຜະລິດທາດໂປຼຕີນມາດຕະຖານແລະການຈັບພາບທີ່ໃຫ້ຜົນຜະລິດສູງ.
ໂຄໂບລ (Co2+)	ປານກາງ	ສູງ	ແອັບພລິເຄຊັນທີ່ມີຄວາມບໍລິສຸດສູງຕ້ອງການສຽງລົບກວນໃນພື້ນຫຼັງຕໍ່າ.
ທອງແດງ (Cu2+)	ສູງຫຼາຍ	ຕໍ່າ	ການວິເຄາະແບບດຶງລົງແບບງ່າຍດາຍ ແລະການປັບປຸງພື້ນຖານ.

ຄວາມໂປ່ງໃສຂອງຜູ້ຂາຍກ່ຽວກັບການວັດແທກປະລິມານຕ້ອງການຄວາມສົນໃຈຢ່າງເຂັ້ມງວດຂອງທ່ານ. ຜູ້ຊື້ມັກຈະບໍ່ສົນໃຈລາຍລະອຽດການລະງັບທາງດ້ານຮ່າງກາຍ. ຢາງພາລາທາງການຄ້າເກືອບສະເຫມີສົ່ງເປັນ suspensions aqueous 50%. ປົກກະຕິແລ້ວພວກມັນລອຍຢູ່ໃນສານກັນບູດເອທານອນ. ຫນຶ່ງມິນລິລິດຂອງ 'ປະລິມານຕຽງ' ຕົວຈິງແລ້ວຕ້ອງການໃຫ້ທ່ານທໍ່ນ້ໍາສອງມິນລິລິດ. ການບໍ່ຄິດໄລ່ອັດຕາສ່ວນນີ້ເຮັດໃຫ້ເຄິ່ງຫນຶ່ງຂອງຄວາມສາມາດໃນການຜູກມັດທາງທິດສະດີຂອງທ່ານທັນທີ. ການຄິດໄລ່ນີ້ພິສູດໄດ້ວ່າມີຄວາມສໍາຄັນຢ່າງແທ້ຈິງສໍາລັບການຈັດຊື້ແລະຂະຫນາດຂະບວນການ.

ການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງພິທີການ: ວິສະວະກໍາການເລື່ອນຊັ້ນ Imidazole

ການຄວບຄຸມຄວາມຊັດເຈນໃນລະຫວ່າງຂັ້ນຕອນການຜູກມັດແລະການລ້າງແຍກການຊໍາລະລ້າງທີ່ດີຈາກອັນຍິ່ງໃຫຍ່. ທ່ານຕ້ອງແນະນໍາປະລິມານຕ່ໍາລະຫວ່າງ 10 ຫາ 50 mM ໃນໄລຍະການໂຫຼດເບື້ອງຕົ້ນ. ຊັ້ນພື້ນຖານນີ້ຍຶດເອົາສະຖານທີ່ຜູກມັດທີ່ອ່ອນແອຢ່າງຈິງຈັງ. ໂປຣຕີນທີ່ເປັນເຈົ້າພາບ endogenous ມັກຈະມີແທັບ histidine ກະແຈກກະຈາຍ. Bovine Serum Albumin (BSA) ແລະ immunoglobulins ຜູກມັດທີ່ບໍ່ແມ່ນສະເພາະຖ້າປະໄວ້ໂດຍບໍ່ໄດ້ກວດກາ. ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງພື້ນຖານຕ່ໍາເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນສານສະກັດຈາກສານເຄມີ. ມັນຢ່າງຫ້າວຫັນປ້ອງກັນສິ່ງສົກກະປົກທີ່ອຸກອັ່ງເຫຼົ່ານີ້ຈາກການຕິດຢູ່ກັບມາຕຣິກເບື້ອງ.

ໄລຍະ elution ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນນະໂຍບາຍດ້ານຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ. ປົກກະຕິແລ້ວທ່ານຕ້ອງການລະຫວ່າງ 200 ແລະ 500 mM ເພື່ອທໍາລາຍສະລັບສັບຊ້ອນ. ຂອບເຂດທີ່ຮຸກຮານນີ້ຖ້ວມສະພາບແວດລ້ອມທ້ອງຖິ່ນຢ່າງສົມບູນ. ໂຄດຄໍາສັ່ງ polyhistidine ພຽງແຕ່ບໍ່ສາມາດຮັກສາການຈັບຂອງມັນຕໍ່ກັບຫຼາຍລ້ານໂມເລກຸນທີ່ແຂ່ງຂັນ. ທ່ານສາມາດນໍາໃຊ້ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນນີ້ເປັນຂັ້ນຕອນການ elution ທັນທີທັນໃດຫຼື gradient ເປັນເສັ້ນ. ຂັ້ນຕອນ elutions ສ້າງຈຸດສູງສຸດ sharper ແຕ່ບາງຄັ້ງ drag impurities ຕາມ. ການສີເສັ້ນຊື່ໃຫ້ຄວາມລະອຽດສູງສຸດທີ່ດີຂຶ້ນເມື່ອແຍກຕົວແປ multimeric ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັນຢ່າງໃກ້ຊິດ.

ຂໍ້ ຈຳ ກັດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ທາງເຄມີ ກຳ ນົດການສ້າງບັບເຟີຂອງທ່ານຢ່າງໃຫຍ່ຫຼວງ. ສານເສບຕິດທົ່ວໄປທີ່ແນ່ນອນທໍາລາຍສະພາບແວດລ້ອມການປະສານງານທີ່ລະອຽດອ່ອນ. ທ່ານຕ້ອງກວດສອບ lysis buffers ຂອງທ່ານຢ່າງລະອຽດກ່ອນທີ່ຈະໂຫລດ.

ຕົວແທນການຫຼຸດຜ່ອນ: ຮັກສາ Dithiothreitol (DTT) ຕ່ໍາກວ່າ 5 mM. ປະລິມານທີ່ສູງຂຶ້ນຢ່າງຈິງຈັງຫຼຸດຜ່ອນ ion ໂລຫະ. ເຈົ້າຈະເຫັນຢາງປ່ຽນເປັນສີນ້ຳຕານທີ່ໜ້າກຽດ.
Chelators ທີ່ເຂັ້ມແຂງ: ຮັກສາ EDTA ຕ່ໍາກວ່າ 1 mM. EDTA ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນ hexadentate chelator. ມັນລອກເອົາໂລຫະອອກໂດຍກົງຈາກ NTA matrix. ຢາງຈະປ່ຽນເປັນສີຂາວ.
Amines ປະຖົມ: ຫຼີກເວັ້ນການ Tris buffer ຖ້າເປັນໄປໄດ້. Tris ທີ່ມີ molarity ສູງສາມາດພົວພັນກັບເປົ້າຫມາຍຂອງທ່ານຢ່າງອ່ອນໂຍນ, ເຮັດໃຫ້ຜົນຜະລິດໂດຍລວມຫຼຸດລົງ. ໃຊ້ໂຊດຽມຟອສເຟດແທນ.

ການແກ້ໄຂບັນຫາຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງ IMAC: ເມື່ອໄດນາມິກແຕກຫັກ

ບາງຄັ້ງທາດໂປຼຕີນຈາກເປົ້າຫມາຍຂອງທ່ານລົ້ມເຫລວຢ່າງສົມບູນ. ທ່ານຕ້ອງແຍກຄວາມແຕກຕ່າງຢ່າງໄວວາລະຫວ່າງຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງສານເຄມີແລະຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງ steric. ກວດເບິ່ງລໍາດັບຂອງທ່ານກ່ອນ. ແທັກຂອງລາວອາດຈະຖືກຝັງເລິກຢູ່ໃນແກນພັບ 3D ຂອງໂປຣຕີນ. ສະຖານທີ່ຜູກມັດພຽງແຕ່ບໍ່ສາມາດເຂົ້າຫາໂລຫະໄດ້. ໂຊກດີ, ເຄມີສາດ IMAC ບໍ່ຕ້ອງການທາດໂປຼຕີນທີ່ພັບເພື່ອເຮັດວຽກ. ທ່ານສາມາດປ່ຽນທັງຫມົດເພື່ອສະພາບການ denaturing. ການເພີ່ມ 8M urea unravels ທາດໂປຼຕີນຢ່າງສົມບູນ. ນີ້ເປີດເຜີຍແທັກທີ່ຖືກຝັງໄວ້, ການຟື້ນຟູຄວາມສາມາດໃນການຜູກມັດຢ່າງເຕັມທີ່ທັນທີ.

elution ກ່ອນໄວອັນຄວນໃນລະຫວ່າງການລ້າງຂັ້ນຕອນຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການເພີ່ມປະສິດທິພາບເກີນ. ຖ້າທາດໂປຼຕີນຂອງເຈົ້າລ້າງອອກກ່ອນຂັ້ນຕອນສຸດທ້າຍ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງພື້ນຖານແມ່ນສູງເກີນໄປ. ໂມເລກຸນຄູ່ແຂ່ງກໍາລັງເຄື່ອນຍ້າຍເປົ້າໝາຍຂອງເຈົ້າກ່ອນໄວອັນຄວນ. ອີກທາງເລືອກ, ກວດເບິ່ງ pH buffer ຂອງທ່ານຢ່າງລະມັດລະວັງ. ໄດນາມິກການຜູກມັດທີ່ສໍາຄັນຈະລົ້ມລົງຖ້າ pH ຫຼຸດລົງຕໍ່າກວ່າ 7.0 ໂດຍບໍ່ໄດ້ຕັ້ງໃຈ. pH ຕ່ໍາ protonates ຄູ່ດຽວໄນໂຕຣເຈນໄວ້ທີ່ສໍາຄັນ. ເມື່ອ protonated, ມັນສູນເສຍຄວາມສາມາດໃນການເຮັດວຽກເປັນຖານ Lewis. ກວດເບິ່ງ pH ຂອງທ່ານສະເຫມີຫຼັງຈາກການລະລາຍເກືອທັງຫມົດ.

ຫຼັກການການອີ່ມຕົວເຮັດໃຫ້ຄວາມລຶກລັບຂອງຄວາມສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ທົ່ວໄປ. ການນໍາໃຊ້ຢາງຫຼາຍບໍ່ເທົ່າກັບຜົນໄດ້ຮັບທີ່ດີກວ່າ. ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ້ໍາຢາງຫຼາຍເກີນໄປມັກຈະຫຼຸດຜ່ອນຄວາມບໍລິສຸດໂດຍລວມ. ຄິດເຖິງປະກົດການຂັດຂວາງແບບສະເຕີລິງຄືກັບຖົງມືເບດບານ. ຖົງມືດຽວສາມາດຖືລູກກອຟຂະຫນາດນ້ອຍຫຼາຍລູກໄດ້ຢ່າງງ່າຍດາຍ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ມັນສາມາດຖືໄດ້ພຽງແຕ່ຫນຶ່ງ volleyball ຂະຫນາດໃຫຍ່. ໂປຣຕີນທີ່ມີຂະໜາດໃຫຍ່ຈະຂັດຂວາງສະຖານທີ່ຜູກມັດທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງ. ທ່ານຕ້ອງຄິດໄລ່ປະລິມານຕຽງນອນຕໍາ່ສຸດທີ່ຕ້ອງການຢ່າງຖືກຕ້ອງ. ການບີບອັດມາທຣິກໂດຍເຈດຕະນາບັງຄັບໃຫ້ເປົ້າໝາຍທີ່ມີສະໜິດສະໜົມສູງເພື່ອຍ້າຍສິ່ງປົນເປື້ອນທີ່ຜູກມັດອ່ອນໆອອກທາງຮ່າງກາຍ.

ການປຸງແຕ່ງຫຼັງການອອກລິດ: ການກຳຈັດ Imidazole ລົງລຸ່ມ

ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍທາງທຸລະກິດຂອງການປົນເປື້ອນທີ່ຕົກຄ້າງຂະຫຍາຍອອກໄປໄກກວ່າການຊໍາລະລ້າງເບື້ອງຕົ້ນ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຄູ່ແຂ່ງສູງແຊກແຊງຢ່າງຈິງຈັງກັບການວິເຄາະທາງລຸ່ມທີ່ສໍາຄັນ. ພວກມັນທຳລາຍໜ້າຈໍການໄປເຊຍກັນທີ່ລະອຽດອ່ອນເປັນປະຈຳ. ພວກເຂົາເຈົ້າຍັງສັບສົນສູດການປິ່ນປົວໂດຍການປ່ຽນແປງ osmolarity ທ້ອງຖິ່ນ. ທ່ານບໍ່ສາມາດພຽງແຕ່ປ່ອຍໃຫ້ eluate ບໍ່ໄດ້ຮັບການສໍາພັດ. ທ່ານຕ້ອງອອກແບບຂັ້ນຕອນການໂຍກຍ້າຍທີ່ອຸທິດຕົນເພື່ອຮັບປະກັນກິດຈະກໍາທາງຊີວະພາບຄົງທີ່ສໍາລັບການທົດສອບທີ່ເປັນປະໂຫຍດ.

ການປະເມີນວິທີການກໍາຈັດມາດຕະຖານຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການດຸ່ນດ່ຽງເວລາຕໍ່ກັບການຂະຫຍາຍ. ທາດໂປຼຕີນຈາກ desalting ແລະ dialysis ເປັນຕົວແທນສອງທາງເລືອກຕົ້ນຕໍຂອງທ່ານ. Dialysis ຍັງຄົງມີຄ່າໃຊ້ຈ່າຍສູງສໍາລັບການຄົ້ນຄວ້າຂະຫນາດນ້ອຍ. ທ່ານປະທັບຕາທາດໂປຼຕີນໃນເຍື່ອເຄິ່ງ permeable ແລະປ່ອຍໃຫ້ການແຜ່ກະຈາຍເຮັດວຽກ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, dialysis ໃຊ້ເວລາຫຼາຍຊົ່ວໂມງ. Desalting columns leverage Size Exclusion Chromatography (SEC). ທາດໂປຼຕີນຂະຫນາດໃຫຍ່ເດີນທາງຢ່າງໄວວາໂດຍຜ່ານປະລິມານທີ່ບໍ່ມີປະໂຫຍດ. ໂມເລກຸນນ້ອຍໆຖືກຕິດຢູ່ພາຍໃນລູກປັດທີ່ມີຮູຂຸມຂົນ. SEC ສະຫນອງການສົ່ງຜ່ານຢ່າງໄວວາ, ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ສໍາລັບໄລຍະເວລາການຜະລິດການຄ້າ.

ສໍາລັບຄໍາຮ້ອງສະຫມັກທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ, ທ່ານສາມາດນໍາໃຊ້ຍຸດທະສາດທີ່ແຕກຕ່າງກັນທັງຫມົດ. ວິທີການ elution ທີ່ບໍ່ມີຄູ່ແຂ່ງ bypasses ການແຂ່ງຂັນເຄມີທັງຫມົດ. ທ່ານຈັດການສະພາບແວດລ້ອມທາງດ້ານຮ່າງກາຍແທນ.

ການລ້າງເບື້ອງຕົ້ນ: ເຮັດຄວາມສະອາດຖັນທີ່ບັນຈຸຢູ່ໃນ pH ຄົງທີ່ຂອງ 8.0 ເພື່ອເອົາສິ່ງເສດເຫຼືອທີ່ບໍ່ກ່ຽວຂ້ອງອອກ.
ການຢອດຄັ້ງທຳອິດ: ຫຼຸດການຊັກລ້າງເທື່ອລະໜ້ອຍລົງເປັນ pH 7.4. ອັນນີ້ເລີ່ມເຮັດໃຫ້ການໂຕ້ຕອບທີ່ບໍ່ສະເພາະເຈາະຈົງ.
ການລ້າງເລິກ: ຫຼຸດລົງ pH ຕື່ມອີກເປັນ 6.5. ທາດໂປຼຕີນທີ່ເປັນເຈົ້າພາບທີ່ມີສານຕົກຄ້າງ histidine ແບບສຸ່ມຈະກໍາຈັດແລະລ້າງອອກຫມົດ.
Elution ສຸດທ້າຍ: ນຳໃຊ້ elution buffer ທີ່ pH 5.5 ຫາ 6.0. ນີ້ protonates ໂຄດຄໍາສັ່ງ polyhistidine. ໂຄດຄໍາສັ່ງສູນເສຍຄຸນສົມບັດຖານ Lewis ແລະປ່ອຍອອກມາຢ່າງສະອາດໂດຍບໍ່ມີການເພີ່ມໂມເລກຸນຄູ່ແຂ່ງ.

ສະຫຼຸບ

Mastering ຜົນສໍາເລັດ IMAC ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການດຸ່ນດ່ຽງທີ່ລະອຽດອ່ອນຂອງ Lewis acid-base ເຄມີສາດ. ການຄວບຄຸມ gradient ຄວາມແມ່ນຍໍາໂດຍກົງກໍານົດຄຸນນະພາບຜະລິດຕະພັນສຸດທ້າຍຂອງທ່ານ. ທ່ານຕ້ອງຈັບຄູ່ເລຂາຄະນິດ resin ທີ່ເຫມາະສົມກັບເປົ້າຫມາຍຄວາມບໍລິສຸດສະເພາະຂອງທ່ານ. ຢ່າສົມມຸດວ່າກຳລັງ electrostatic ຄວບຄຸມຖັນຂອງເຈົ້າ. ໃຫ້ການປິ່ນປົວຂະບວນການເປັນສົມຜົນ mimicry ໂຄງສ້າງການແຂ່ງຂັນ. ການຄວບຄຸມສະພາບແວດລ້ອມຈຸນລະພາກຢ່າງຖືກຕ້ອງຮັບປະກັນການແຜ່ພັນທີ່ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້.

ຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປທີ່ສາມາດປະຕິບັດໄດ້ຂອງທ່ານເລີ່ມຢູ່ໃນຫ້ອງທົດລອງໃນມື້ນີ້. ກ່ອນອື່ນ ໝົດ, ກວດເບິ່ງຂໍ້ບົກຜ່ອງໃນການເຮັດຄວາມສະອາດໃນປະຈຸບັນຂອງທ່ານຢ່າງໃກ້ຊິດ. ທ່ານກຳລັງປະສົບກັບສຽງລົບກວນໃນພື້ນຫຼັງສູງບໍ? ປະເມີນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງບັຟເຟີການລ້າງຂອງທ່ານຄືນໃໝ່ໃນທັນທີ. ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າທ່ານໃຊ້ປະລິມານຕຽງຕໍາ່ສຸດທີ່ທີ່ຈໍາເປັນເພື່ອກະຕຸ້ນການເຕົ້າໂຮມກັນຢ່າງເຂັ້ມງວດ. ສຸດທ້າຍ, ຖ້າການຮົ່ວໄຫຼຂອງໂລຫະເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມພະຍາຍາມໃນຂະຫນາດຂອງທ່ານ, ປ່ຽນ matrix ຂອງທ່ານຈາກ IDA ເປັນ NTA ທັນທີ.

FAQ

ຖາມ: ເປັນຫຍັງຂ້ອຍຈຶ່ງບໍ່ສາມາດໃຊ້ NaCl (ເກືອ) ເພື່ອເອົາທາດໂປຼຕີນຈາກລາວແທນ imidazole?

A: ເກືອຂັດຂວາງພັນທະບັດ ionic ງ່າຍດາຍ. ພວກເຮົາໃຊ້ເກືອຕົ້ນຕໍໃນ Ion Exchange Chromatography. IMAC ອີງໃສ່ການປະສານງານພັນທະບັດ covalent ທັງຫມົດໂດຍຜ່ານ Lewis acid-base ເຄມີ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງຂອງ NaCl ບໍ່ສາມາດທໍາລາຍສະລັບສັບຊ້ອນປະສານງານທີ່ຫມັ້ນຄົງເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. ທ່ານຕ້ອງການແບບຈໍາລອງໂຄງສ້າງເພື່ອແຂ່ງຂັນສໍາລັບສະຖານທີ່ຜູກມັດໂລຫະສະເພາະ.

ຖາມ: ເປັນຫຍັງຂ້ອຍຈຶ່ງບໍ່ສາມາດໃຊ້ສານ Nickel ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງເພື່ອຍົກທາດໂປຼຕີນຂອງຂ້ອຍ?

A: Ni2+ ion ຟຣີໃນ elution buffer ຂອງທ່ານມີຄ່າບວກ. nickel immobilized ທີ່ອາໄສຢູ່ໃນຢາງຂອງທ່ານຍັງມີຄ່າບວກ. ມາຕຣິກເບື້ອງຄົງທີ່ຮຸກຮານ repels ion ຟຣີ. ໂລຫະທີ່ບໍ່ເສຍຄ່າພຽງແຕ່ໄຫລຜ່ານຄໍລໍາຂອງເຈົ້າໂດຍບໍ່ເຄີຍຍ້າຍທາດໂປຼຕີນຈາກເປົ້າຫມາຍຂອງເຈົ້າ.

ຖາມ: ຂ້ອຍຈະເອົາ imidazole ອອກຈາກຢາງ Ni-NTA ຂອງຂ້ອຍໄດ້ແນວໃດສໍາລັບການເກັບຮັກສາ / ການສ້າງໃຫມ່?

A: ໂມເລກຸນຄູ່ແຂ່ງຮັກສາຄວາມຜູກພັນທີ່ຂ້ອນຂ້າງຕໍ່າສໍາລັບ nickel ເມື່ອທຽບກັບແທັກ hexahistidine. ທ່ານບໍ່ຕ້ອງການຕົວແທນການລອກເອົາ harsh. ພຽງແຕ່ລ້າງຖັນຢ່າງລະອຽດດ້ວຍ buffer ທີ່ແລ່ນເກີນຈະຍ້າຍມັນໄດ້ຢ່າງງ່າຍດາຍ. ປະຕິບັດຕາມຂັ້ນຕອນນີ້ດ້ວຍນ້ໍາກັ່ນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເກັບຮັກສາຢາງໄດ້ຢ່າງປອດໄພໃນ 20% ethanol.