Imidazole က နီကယ်နဲ့ ဘယ်လိုချိတ်သလဲ။

ကိုက်ညီမှုမရှိသော ပရိုတင်းဓာတ်သန့်စင်မှုအထွက်နှုန်းသည် ရာသီအလိုက်ဓာတ်ခွဲခန်းမန်နေဂျာများကိုပင် စိတ်ပျက်စေတတ်သည်။ ရေအောက်ပိုင်း စီမံဆောင်ရွက်ရေး အင်ဂျင်နီယာ အများအပြားသည် သန့်ရှင်းမှု ညံ့ဖျင်းခြင်း သို့မဟုတ် မမျှော်လင့်ထားသော ပစ်မှတ်များ ဆုံးရှုံးခြင်းကို နေ့စဉ်နှင့်အမျှ ရင်ဆိုင်နေကြရသည်။ တိကျသောညှိနှိုင်းပေါင်းစပ်ဓာတုဗေဒနှင့်ကိုက်ညီရန် ကြားခံအာရုံစူးစိုက်မှုကို ချိန်ညှိခြင်းထက် ၎င်းတို့သည် ယေဘုယျပရိုတိုကောများကို အားကိုးလေ့ရှိသည်။ Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) သည် လုံးဝတိကျမှုကို တောင်းဆိုသည်။ သင်၏ပစ်မှတ်မော်လီကျူး၏ထူးခြားသောစည်းနှောင်မှုဒိုင်းနမစ်များကိုလျစ်လျူရှုပါက၊ သင်သည်ပြင်းထန်သောအလုပ်အသွားအလာပိတ်ဆို့မှုများကိုအန္တရာယ်ဖြစ်စေနိုင်သည်။ ဤဆောင်းပါးသည် ကြားရှိ အခြေခံဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ဆက်ဆံရေးကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းဖော်ပြပါသည်။ imidazole နှင့် နီကယ်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် သီအိုရီပိုင်းဆိုင်ရာယန္တရားများမှ လက်တွေ့အစေးရွေးချယ်မှုစံနှုန်းများဆီသို့ ချောမွေ့စွာကူးပြောင်းပါသည်။ His-tag elution protocols များကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ရန် အထောက်အထားအခြေခံမူဘောင်တစ်ခုကို သင်တွေ့ရှိလိမ့်မည်။ အဖြစ်များသော သန့်စင်မှုချို့ယွင်းချက်များကို ထိရောက်စွာဖြေရှင်းနည်းကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ အကျုံးဝင်ပါသည်။ ဤမရှိမဖြစ်လိုအပ်သော ဓာတုဗေဒကို နားလည်ခြင်းဖြင့် ကြိုတင်မှန်းဆ၍မရသော စမ်းသပ်မှုရလဒ်များကို အလွန်အတိုင်းအတာအထိ ယုံကြည်စိတ်ချရသော ရေအောက်ပိုင်းလုပ်ငန်းစဉ်များအဖြစ် ပြောင်းလဲပေးပါသည်။

သော့ထုတ်ယူမှုများ

• ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံ အတုခိုးခြင်း- Imidazole သည် ၎င်း၏အဖွဲ့ဝင်ငါးဦးပါရှိသည့် လက်စွပ်ဖွဲ့စည်းပုံသည် နီကယ်ညှိနှိုင်းသည့်နေရာများတွင် ပစ်မှတ်ပရိုတင်းကို တိုက်ရိုက်ရွှေ့ပြောင်းပေးသည့် လူးဝစ်အခြေစိုက်စခန်းတစ်ခုအနေဖြင့် လုပ်ဆောင်သောကြောင့်၊ Imidazole သည် histidine တဂ်များကို ယှဉ်နိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။

• အစေးရွေးချယ်ရေးကိစ္စများ- နီကယ်-imidazole အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှု၏ တည်ငြိမ်မှုသည် အသုံးပြုထားသော chelating ligand ပေါ်တွင် များစွာမူတည်သည် (ဥပမာ- 4-dentate NTA သည် 3-dentate IDA ထက် သတ္တုများ ယိုစိမ့်ခြင်းကို တားဆီးပေးသည်)။

• Control Dial အဖြစ် အာရုံစူးစိုက်မှု- ပေါင်းစပ်ထားစဉ် (10-25 mM) တွင် imidazole ၏ တိကျစွာချိန်ညှိမှုသည် လက်ခံပရိုတင်းဝင်ရောက်စွက်ဖက်မှုကို လျော့နည်းစေပြီး မြင့်မားသောပြင်းအား (200-500 mM) သည် ပစ်မှတ်အား elution ကိုဖြစ်စေသည်။

• ဓာတုဗေဒအပြင်- 'Saturation Effect' (အစေးထုထည်နှင့် ပရိုတင်းဒြပ်ထု) ကဲ့သို့သော ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာအချက်များသည် မြင့်မားသောသန့်စင်မှုကိုရရှိရန်အတွက် ကြားခံဓာတုဗေဒကဲ့သို့ အရေးကြီးပါသည်။

မော်လီကျူးယန္တရား- Lewis Acids၊ Bases နှင့် Structural Mimicry

အစပြုသူတော်တော်များများက electrostatic attraction က column binding ကို drive လို့ယူဆကြပါတယ်။ ဤနာမည်ကြီး ဒဏ္ဍာရီသည် ကျယ်ပြန့်သော ပရိုတိုကော အမှားများကို ဖြစ်စေသည်။ ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ pH တွင်၊ histidine သည် အလွန်ကြားနေပါသည်။ စစ်မှန်သော အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုသည် သြဒိနိတ် covalentနှောင်ကြိုးများပေါ်တွင် လုံးလုံးလျားလျားမှီခိုနေပါသည်။ ဒါကို Lewis acid-base chemistry လို့ ခေါ်ပါတယ်။ ဤစနစ်တွင်၊ နစ်ကယ်သည် အီလက်ထရွန်လက်ခံသည့်အရာအဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။ နိုက်ထရိုဂျင်အက်တမ်ပေါ်ရှိ တစ်ဦးတည်းသော အီလက်ထရွန်တစ်စုံသည် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော အလှူရှင်အဖြစ် ဆောင်ရွက်သည်။ IMAC elution ကို ကျွမ်းကျင်စေရန် ဤ-အိုင်ယွန်မဟုတ်သော ယန္တရားကို သင်နားလည်ရပါမည်။ စနစ်ကို ရိုးရှင်းသော အိုင်းယွန်းလဲလှယ်ကော်လံကဲ့သို့ ဆက်ဆံပါက၊ သင်၏ သန့်စင်မှု ပျက်ကွက်မည်ဖြစ်သည်။

ဖွဲ့စည်းပုံ အတုခိုးခြင်းသည် ပြိုင်ဆိုင်မှု စည်းနှောင်ခြင်း၏ အဓိက နိယာမကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ မော်လီကျူး ဂျီသြမေတြီကို အနီးကပ်ကြည့်ရှုပါ။ elution အတွက်သုံးသော လုပ်ဆောင်နိုင်သော မော်လီကျူးသည် histidine အကြွင်းအကျန်၏ တက်ကြွသော ဘေးထွက်ကွင်းဆက်နှင့် တူညီပါသည်။ သူတို့သည် တူညီသော အဖွဲ့ဝင်ငါးဦးပါ လက်စွပ်ဖွဲ့စည်းပုံကို မျှဝေကြသည်။ ဤအခမဲ့ပြိုင်ဖက်ကို စနစ်ထဲသို့ သင်မိတ်ဆက်ပေးသောအခါ၊ ၎င်းသည် တူညီသောရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာနေရာများအတွက် တက်ကြွစွာတိုက်ခိုက်သည်။ နီကယ်အိုင်းယွန်းသည် လွတ်လပ်သောလက်စွပ်နှင့် တဂ်ထားသော ပရိုတင်းတို့ကို ခွဲခြား၍မရပါ။ ၎င်းတို့နှစ်ဦးစလုံးသည် တူညီသော အီလက်ထရွန်လှူဒါန်းသည့် မျက်နှာများကို သတ္တုစင်တာသို့ တင်ပြကြသည်။

ယန္တရားသည် အပြိုင်အဆိုင် အတုခိုးခြင်းအပေါ် ကြီးကြီးမားမား မှီခိုနေသောကြောင့် အောင်မြင်သော elution သည် ကိန်းဂဏန်းဂိမ်းသက်သက် ဖြစ်လာသည်။ သင့်အစေးပေါ်တွင် အသုံးပြုနိုင်သော နီကယ်ချိတ်ဆိုဒ်များ သတ်မှတ်ထားသော နံပါတ်တစ်ခုရှိသည်။ polyhistidine တက်ဂ်သည် အကြွင်းအကျန်များစွာ၏ အငွေ့အသက်သက်ရောက်မှုကြောင့် ခိုင်ခံ့စွာ ချည်နှောင်ထားသည်။ သို့သော်၊ ကော်လံကို ရေလွှမ်းမိုးခြင်းသည် သင်္ချာဆိုင်ရာ အားသာချက်ကို ပြောင်းပြန်လှန်သည်။ ကြီးမားသောအာရုံစူးစိုက်မှုအခမဲ့ imidazole သည် ပတ်ဝန်းကျင်ကို လွှမ်းမိုးစေသည်။ ၎င်းသည် လွှမ်းခြုံထားသော မော်လီကျူးများ ရှိနေခြင်းမှတစ်ဆင့် tag ကို သာလွန်စေသည်။ ဤအစုလိုက်အပြုံလိုက် ရွှေ့ပြောင်းခြင်းသည် ပစ်မှတ်ပရိုတင်းကို ကော်လံတစ်လျှောက်တွင် ထုတ်လွှတ်ပြီး စီးဆင်းစေရန် တွန်းအားပေးသည်။

Binding Chemistry ကို Resin Selection Criteria သို့ ဘာသာပြန်ခြင်း။

chelator ဂျီသြမေတြီများကို အကဲဖြတ်ခြင်းသည် သင်၏နောက်ဆုံးထွက်နှုန်းကို တိုက်ရိုက်အကျိုးသက်ရောက်သည်။ အစိုင်အခဲထောက်ခံမှုအစေးသည် နီကယ်အိုင်းယွန်းကို လုံခြုံစွာ ထိန်းထားရမည်။ Standard Nitrilotriacetic acid (NTA) သည် ပင်မညှိနှိုင်းရေးဆိုဒ်လေးခုကို အသုံးပြုသည်။ ဤ tetradentate အစီအစဉ်သည် သတ္တုကို လုံခြုံစွာ ဖမ်းသည်။ ၎င်းသည် histidine တက်ဂ်အတွက် ညှိနှိုင်းရေးဆိုက်နှစ်ခုတိတိကို ဖွင့်ထားပေးသည်။ အသက်ကြီးသော Iminodiacetic acid (IDA) သည် ပေါင်းစပ်ဆိုဒ် သုံးခုကိုသာ အသုံးပြုသည်။ IDA သည် သတ္တုကို ပို၍ ပျော့ပျောင်းစွာ ကိုင်ဆောင်သည်။ NTA သည် အလွန်စုစည်းထားသော elution အဆင့်များအတွင်း မလိုလားအပ်သော နီကယ်ယိုစိမ့်မှုကို ကန့်သတ်ထားသည်။ သတ္တုရည်ဆမ်းခြင်းကို လျှော့ချခြင်းသည် အတိုင်းအတာကြီးမားသော ဆေးဝါးထုတ်လုပ်ခြင်းအတွက် အရေးကြီးသော လိုက်နာမှုအချက်တစ်ခုအဖြစ် ကျန်ရှိနေပါသည်။

အောက်တွင် IDA နှင့် NTA resins တို့၏ structural dynamics များကို နှိုင်းယှဉ်ထားသော အကျဉ်းချုပ်ဇယားတစ်ခုဖြစ်သည်။

Resin Chelator	ညှိနှိုင်းရေးဆိုဒ်များကို အသုံးပြုသည်။	ပရိုတင်းအတွက်ဆိုက်များကိုဖွင့်ပါ။	သတ္တု Leaching အန္တရာယ်
IDA (Iminodiacetic acid)	3 (တြိဂတ်)	3	မြင့်မားခြင်း (အထူးသဖြင့် မြင့်မားသော elution molarities)၊
NTA (Nitrilotriacetic acid)	4 (Tetradentate)	2	နိမ့်သည် (အသွင်ပြောင်းသတ္တုများကို တင်းတင်းကျပ်ကျပ် ချည်နှောင်ထားသည်)

မှန်ကန်သောအကူးအပြောင်းသတ္တုကိုရွေးချယ်ခြင်းသည် သင်၏အခြေခံသတ်မှတ်ချက်ကို ပြောင်းလဲစေသည်။ သင်သည် သင်၏ သီးခြား ရေအောက် ပန်းတိုင်များနှင့် သတ္တုကို ကိုက်ညီရပါမည်။ နီကယ်သည် မြင့်မားသောစွမ်းရည်အတွက် စက်မှုလုပ်ငန်းစံနှုန်းကို ကိုယ်စားပြုသည်။ ၎င်းသည် ယေဘူယျရည်ရွယ်ချက်ဖြင့် ဖမ်းယူမှုကို လှပစွာကိုင်တွယ်သည်။ Cobalt သည် အားနည်းသော ပေါင်းစပ်ဆက်စပ်မှုကို အလုံးစုံပေးစွမ်းသည်။ သင်၏ပစ်မှတ်ကို ကိုဘော့မှ ချေဖျက်ရန် ပြိုင်ဖက် မော်လီကျူးများ လိုအပ်ပါသည်။ သို့သော်၊ ကိုဘော့သည် နောက်ခံအိမ်ရှင်ပရိုတင်းများကို ထိထိရောက်ရောက် ငြင်းပယ်ခြင်းဖြင့် အလွန်သာလွန်သော သန့်ရှင်းစင်ကြယ်မှုကို ပေးစွမ်းသည်။ ကြေးနီသည် အမြင့်ဆုံးစည်းနှောင်အားကို ပေးစွမ်းသော်လည်း အနိမ့်ဆုံးတိကျမှုကို ပေးသည်။ ELISA coating ကဲ့သို့ ရိုးရှင်းသော ကြွယ်ဝသည့် လုပ်ငန်းဆောင်တာများအတွက် ကြေးနီကို သိမ်းဆည်းထားသင့်သည်။

သတ္တုအိုင်းယွန်း	ရင်းနှီးမှု	တိကျမှု	အကောင်းဆုံးအသုံးပြုမှု Case
နီကယ် (Ni2+)	မြင့်သည်။	တော်ရုံတန်ရုံ	စံချိန်မီ ပရိုတင်းထုတ်လုပ်မှုနှင့် အထွက်နှုန်းမြင့်မားစွာ ဖမ်းယူနိုင်ခြင်း။
ကိုဘော့ (Co2+)	တော်ရုံတန်ရုံ	မြင့်သည်။	နောက်ခံဆူညံသံနည်းပါးသော သန့်စင်မှုမြင့်မားသော အပလီကေးရှင်းများ။
ကြေးနီ (Cu2+)	အရမ်းမြင့်တယ်။	နိမ့်သည်။	ရိုးရှင်းသော ဆွဲချစမ်းသပ်မှုများနှင့် အခြေခံ ကြွယ်ဝမှု။

ထုထည်မက်ထရစ်များနှင့် ပတ်သက်၍ ရောင်းချသူ၏ ပွင့်လင်းမြင်သာမှုသည် သင်၏ တင်းကြပ်သော အာရုံစိုက်မှု လိုအပ်သည်။ ဝယ်ယူသူများသည် ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဆိုင်းထိန်းမှုအသေးစိတ်ကို လျစ်လျူရှုလေ့ရှိသည်။ လုပ်ငန်းသုံး resins သည် 50% aqueous suspensions အဖြစ် အမြဲတမ်းနီးပါး တင်ပို့သည်။ ၎င်းတို့သည် အများအားဖြင့် အီသနော တာရှည်ခံရည်ဖြင့် မျှောကြသည်။ ဖော်ပြထားသည့် 'bed volume' ၏ တစ်မီလီလီတာသည် အမှန်တကယ်ပင် သင့်အား ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ slurry ၏ နှစ်မီလီလီတာ ပိုက်ကို လိုအပ်သည်။ ဤအချိုးကို ထည့်တွက်ရန် ပျက်ကွက်ခြင်းသည် သင်၏ သီအိုရီဆိုင်ရာ ပေါင်းစပ်နိုင်မှု တစ်ဝက်ကို ချက်ချင်း ဆုံးရှုံးစေပါသည်။ ဤတွက်ချက်မှုသည် ဝယ်ယူရေးနှင့် လုပ်ငန်းစဉ်ချဲ့ထွင်ခြင်းအတွက် လုံးဝအရေးကြီးကြောင်း သက်သေပြပါသည်။

Protocol Optimization- Imidazole Gradient ကို အင်ဂျင်နီယာချုပ်

ချည်နှောင်ခြင်းနှင့် ဆေးကြောခြင်းအဆင့်များအတွင်း တိကျသောထိန်းချုပ်မှုသည် ကောင်းမွန်သောသန့်စင်မှုများကို ကြီးမားသောအရာများနှင့် ခွဲခြားထားသည်။ ကနဦးစတင်ခြင်းအဆင့်တွင် သင်သည် 10 မှ 50 mM ကြား အနိမ့်ဆေးများကို မိတ်ဆက်ရပါမည်။ ဤအခြေခံအလွှာသည် အားနည်းသော ချိတ်ဆိုဒ်များကို တက်ကြွစွာ သိမ်းပိုက်သည်။ Endogenous host proteins တွေမှာ ပြန့်ကျဲနေတဲ့ histidine ဖာထေးတာတွေ ပါဝင်တတ်ပါတယ်။ Bovine Serum Albumin (BSA) နှင့် immunoglobulins တို့သည် အတိအကျ မစစ်ဆေးဘဲ ထားခဲ့ပါက ချည်နှောင်သည်။ အောက်ခြေ အာရုံစူးစိုက်မှု နည်းပါးခြင်းသည် ဓါတုဗေဒ တုံ့ပြန်မှုအဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။ ၎င်းသည် ဤစိတ်ပျက်စရာကောင်းသော အညစ်အကြေးများကို မက်ထရစ်သို့ မတွယ်ကပ်စေရန် တက်ကြွစွာ တားဆီးသည်။

elution အဆင့်သည် အာရုံစူးစိုက်မှု ဒိုင်းနမစ်များ ကြီးမားသော ပြောင်းလဲမှုကို တောင်းဆိုသည်။ ရှုပ်ထွေးမှုကို ချိုးဖျက်ရန် သင်သည် များသောအားဖြင့် 200 မှ 500 mM ကြား လိုအပ်သည်။ ဤပြင်းထန်သော ကန့်သတ်ချက်သည် ဒေသခံပတ်ဝန်းကျင်ကို လုံးဝလွှမ်းမိုးသွားစေသည်။ polyhistidine tag သည် သန်းပေါင်းများစွာသော ပြိုင်ဆိုင်သော မော်လီကျူးများကို အလွယ်တကူ မထိန်းနိုင်ပါ။ ဤအာရုံစူးစိုက်မှုကို ရုတ်တရက် လှမ်းပစ်ခြင်း သို့မဟုတ် မျဉ်းဖြောင့်အရောင်အဆင်းအဖြစ် သင်သုံးနိုင်သည်။ ဆင့်ဆင့်ခြင်းများသည် ပိုမိုပြတ်သားသော အထွတ်အထိပ်များကို ဖန်တီးပေးသော်လည်း တစ်ခါတစ်ရံတွင် အညစ်အကြေးများကို ဆွဲယူသွားပါသည်။ အနီးကပ်ဆက်စပ် ကိန်းဂဏန်းမျိုးစုံမျိုးကွဲများကို ပိုင်းခြားသည့်အခါ မျဉ်းဖြောင့်အရောင်ဖျော့ဖျော့များသည် ပိုမိုကောင်းမွန်သော ရုပ်ထွက်ကို ပေးစွမ်းသည်။

ဓာတုသဟဇာတဖြစ်မှုကန့်သတ်ချက်များသည် သင်၏ကြားခံဖော်မြူလာကို ကြီးမားစွာဆုံးဖြတ်ပေးသည်။ အချို့သော အသုံးများသော ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများသည် နူးညံ့သိမ်မွေ့သော ပူးပေါင်းဆောင်ရွက်မှုပတ်ဝန်းကျင်ကို လုံးဝပျက်စီးစေသည်။ မတင်မီတွင် သင်၏ lysis buffers ကို သေချာစွာ စစ်ဆေးရပါမည်။

• လျှော့ချခြင်း- Dithiothreitol (DTT) ကို 5 mM အောက်ထားပါ။ မြင့်မားသောပမာဏသည် သတ္တုအိုင်းယွန်းကို တက်ကြွစွာ လျှော့ချသည်။ အစေးသည် အညိုရောင်ပြောင်းသွားသည်ကို သင်တွေ့လိမ့်မည်။

• ပြင်းထန်သော Chelators- EDTA ကို 1 mM အောက်ထားပါ။ EDTA သည် hexadentate chelator အဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။ ၎င်းသည် သတ္တုကို NTA matrix မှ တိုက်ရိုက်ဖယ်ထုတ်သည်။ သစ်စေးသည် ဖြူစင်သွားလိမ့်မည်။

• Primary Amines- ဖြစ်နိုင်လျှင် Tris ကြားခံကို ရှောင်ပါ။ မြင့်မားသော molarity Tris သည် သင့်ပစ်မှတ်နှင့်အတူ အားနည်းစွာ တုံ့ပြန်နိုင်ပြီး အလုံးစုံအထွက်နှုန်းကို ကျဆင်းစေသည်။ ဆိုဒီယမ်ဖော့စဖိတ်ကို အစားသုံးပါ။

IMAC ပျက်ကွက်မှုများကို ဖြေရှင်းခြင်း- Dynamics ပျက်သွားသောအခါ

တစ်ခါတစ်ရံတွင် သင်၏ပစ်မှတ်ပရိုတင်းကို လုံးဝချိတ်ရန် ပျက်ကွက်သည်။ ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာချို့ယွင်းချက်များနှင့် steric ကျရှုံးမှုများအကြား လျင်မြန်စွာ ပိုင်းခြားနိုင်ရမည်။ သင့်အစီအစဉ်ကို ဦးစွာစစ်ဆေးပါ။ His-tag ကို ပရိုတင်း၏ 3D ခေါက်ထားသော အူတိုင်အတွင်းတွင် နက်ရှိုင်းစွာ မြှုပ်နှံထားနိုင်သည်။ ချည်နှောင်ထားသောဆိုဒ်များသည် သတ္တုကို အလွယ်တကူ မရောက်ရှိနိုင်ပါ။ ကံကောင်းထောက်မစွာ၊ IMAC ဓာတုဗေဒသည် လုပ်ဆောင်ရန် ခေါက်ထားသော ပရိုတင်းကို မလိုအပ်ပါ။ သင်သည် denaturing အခြေအနေသို့ လုံးဝပြောင်းနိုင်သည်။ ယူရီးယား 8M ကို ပေါင်းထည့်ခြင်းက ပရိုတင်းဓာတ်ကို အပြည့်အဝ ဖယ်ရှားပေးပါသည်။ ၎င်းသည် မြှုပ်ထားသော tag ကို ဖော်ထုတ်ပြီး အပြည့်အ၀ စည်းနှောင်နိုင်စွမ်းကို ချက်ချင်းပြန်လည်ရရှိစေသည်။

ရေဆေးသည့်အဆင့်များအတွင်း အချိန်မတန်မီ ဖြုန်းတီးခြင်းသည် ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ခြင်းကို ညွှန်ပြသည်။ အကယ်၍ သင်၏ပရိုတင်းသည် နောက်ဆုံးအဆင့်မမီပါက၊ သင်၏အခြေခံအာရုံစူးစိုက်မှုမှာ အလွန်မြင့်မားပါသည်။ ပြိုင်ဖက် မော်လီကျူးသည် သင့်ပစ်မှတ်ကို အချိန်မတိုင်မီ ရွှေ့ပြောင်းနေပါသည်။ တနည်းအားဖြင့် သင်၏ကြားခံ pH ကို ဂရုတစိုက်စစ်ဆေးပါ။ pH သည် 7.0 အောက်သို့ အမှတ်မထင် ကျဆင်းသွားပါက အရေးကြီးသော binding dynamic သည် ပြိုကျသွားသည်။ pH နိမ့်ခြင်းသည် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော နိုက်ထရိုဂျင်တစ်လုံးတည်းတွဲကို ပရိုတိွန်ဖြစ်စေသည်။ ပရိုတိန်းဓာတ်ပြုပြီးသည်နှင့် ၎င်းသည် လူးဝစ်အခြေစိုက်စခန်းအဖြစ် လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်း ဆုံးရှုံးသွားသည်။ ဆားများအားလုံးပျော်ပြီးနောက် သင်၏ pH ကို အမြဲစစ်ဆေးပါ။

saturation နိယာမသည် သာမန် scalability ဒဏ္ဍာရီကို ကွဲကြေစေသည် ။ စေးများများသုံးခြင်းသည် ပိုမိုကောင်းမွန်သောရလဒ်များနှင့် တူညီမည်မဟုတ်ပေ။ အမှန်မှာ၊ အလွန်အကျွံအစေးသည် အများအားဖြင့် အလုံးစုံသန့်ရှင်းမှုကို လျော့နည်းစေသည်။ ဘေ့စ်ဘောလက်အိတ်ကဲ့သို့ အတားအဆီးအတားအဆီးဖြစ်စဉ်ကို စဉ်းစားကြည့်ပါ။ လက်အိတ်တစ်ခုတည်းသည် သေးငယ်သော ဂေါ့ဖ်ဘောလုံးများစွာကို အလွယ်တကူ ကိုင်ဆောင်နိုင်သည်။ သို့သော် ဘောလီဘောကြီး တစ်လုံးသာ ကိုင်နိုင်သည်။ အရွယ်အစားကြီးသော ပရိုတင်းများသည် ကပ်လျက်ချိတ်ထားသော နေရာများကို ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာအရ ပိတ်ဆို့သည်။ အနည်းဆုံးလိုအပ်သော အိပ်ယာထုထည်ကို တိကျစွာ တွက်ချက်ရပါမည်။ မက်ထရစ်ကို ဇွတ်အတင်း စုစည်းခြင်းဖြင့် အားနည်းသော အညစ်အကြေးများကို ရုပ်ပိုင်းအရ ဖယ်ထုတ်ရန် ဆက်စပ်မှု မြင့်မားသော ပစ်မှတ်များကို တွန်းအားပေးသည်။

သန့်စင်မှု လွန်ကဲခြင်း- အောက်ရေစီးကြောင်း Imidazole ဖယ်ရှားခြင်း။

အကြွင်းအကျန်ညစ်ညမ်းမှု၏ လုပ်ငန်းကုန်ကျစရိတ်သည် ကနဦးသန့်စင်မှုထက် ကျော်လွန်ပါသည်။ မြင့်မားသော ပြိုင်ဖက်ပါဝင်မှုများသည် အရေးကြီးသော ရေအောက်ပိုင်းစစ်ဆေးမှုများကို တက်ကြွစွာ အနှောင့်အယှက်ပေးသည်။ ၎င်းတို့သည် ထိလွယ်ရှလွယ် ပုံဆောင်ခဲဖန်သားပြင်များကို ပုံမှန်ဖျက်ဆီးသည်။ ၎င်းတို့သည် ဒေသတွင်း osmolarity ကိုပြောင်းလဲခြင်းဖြင့် ကုထုံးဖော်မြူလာများကို ရှုပ်ထွေးစေသည်။ သာဓုကို ရိုးရိုးရှင်းရှင်း ချန်ထားလို့ မရပါဘူး။ ဇီဝကမ္မလုပ်ဆောင်မှုဆိုင်ရာ စမ်းသပ်ခြင်းအတွက် နဂိုအတိုင်းရှိနေကြောင်း သေချာစေရန် သီးသန့်ဖယ်ရှားသည့်အဆင့်ကို ဒီဇိုင်းရေးဆွဲရပါမည်။

စံဖယ်ထုတ်ခြင်းနည်းလမ်းများကို အကဲဖြတ်ခြင်းမှာ အတိုင်းအတာအထိ ချိန်ညှိရန် လိုအပ်သည်။ ပရိုတင်းကို ချေမှုန်းခြင်း နှင့် သန့်စင်ခြင်း သည် သင်၏ အဓိက ရွေးချယ်မှု နှစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုသည်။ Dialysis သည် သေးငယ်သော သုတေသနအသုတ်များအတွက် အလွန်စရိတ်သက်သာပါသည်။ သင်သည် ပရိုတင်းကို စိမ့်ဝင်နိုင်သော အမြှေးပါးတစ်ခုတွင် တံဆိပ်ခတ်ပြီး ပျံ့နှံ့မှုကို လုပ်ဆောင်နိုင်စေပါသည်။ သို့သော် dialysis သည် နာရီပေါင်းများစွာ ကြာသည်။ ကော်လံများကို ဖယ်ရှားခြင်းတွင် Size Exclusion Chromatography (SEC) ကို လွှမ်းမိုးသည်။ ကြီးမားသော ပရိုတင်းများသည် ပျက်ပြယ်သော ထုထည်မှတဆင့် လျင်မြန်စွာ သွားလာကြသည်။ သေးငယ်သော မော်လီကျူးများသည် ပေါက်ရောက်သော ပုတီးစေ့များအတွင်းတွင် ပိတ်မိနေသည်။ SEC သည် ကူးသန်းရောင်းဝယ်ရေး ထုတ်လုပ်မှု အချိန်ဇယားများအတွက် လျင်မြန်သော၊ အတိုင်းအတာဖြင့် ဆောင်ရွက်နိုင်သည် ။

အလွန်ထိခိုက်လွယ်သော အက်ပ်များအတွက်၊ သင်သည် လုံးဝကွဲပြားခြားနားသော နည်းဗျူဟာကို အသုံးပြုနိုင်သည်။ ပြိုင်ဖက်ကင်းစင်သော ပြိုင်ဆိုင်မှုနည်းလမ်းသည် ဓာတုပြိုင်ဆိုင်မှုကို လုံးဝရှောင်လွှဲသည်။ သင်သည် ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာပတ်ဝန်းကျင်ကို လှည့်စားမည့်အစား

1. ကနဦးဆေးကြောခြင်း- မဆက်စပ်သောအပျက်အစီးများကိုဖယ်ရှားရန် တည်ငြိမ်သော pH 8.0 တွင် တင်ထားသောကော်လံကို သန့်ရှင်းပါ။

2. ပထမအစက်- လက်ဆေးကြားခံကို pH 7.4 သို့ ဖြည်းဖြည်းချင်း လျှော့ချပါ။ ၎င်းသည် သီးခြားမဟုတ်သော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများကို အားနည်းစေပါသည်။

3. Deep Wash- pH ကို 6.5 သို့ ထပ်မံချပေးပါ။ ကျပန်း histidine အကြွင်းအကျန်များပါရှိသော ပရိုတိန်းများကို ဖယ်ထုတ်ပြီး လုံးလုံးလျားလျား ဖယ်ရှားပေးပါသည်။

4. နောက်ဆုံးအဆင့်- pH 5.5 မှ 6.0 တွင် elution ကြားခံကို အသုံးပြုပါ။ ၎င်းသည် polyhistidine tag ကို protonate ဖြစ်စေသည်။ တက်ဂ်သည် ၎င်း၏ Lewis အခြေခံ ဂုဏ်သတ္တိများ ဆုံးရှုံးသွားပြီး ပြိုင်ဖက် မော်လီကျူးများ မပါဘဲ သန့်ရှင်းစွာ ထုတ်လွှတ်သည်။

နိဂုံး

IMAC အောင်မြင်မှုကို ကျွမ်းကျင်ပိုင်နိုင်စွာ ထိန်းညှိရန် နူးညံ့သိမ်မွေ့သော Lewis acid-base chemistry လိုအပ်ပါသည်။ တိကျသော gradient ထိန်းချုပ်မှုသည် သင်၏နောက်ဆုံးထုတ်ကုန်အရည်အသွေးကို တိုက်ရိုက်ဖော်ပြသည်။ သင့်လျော်သော အစေးဂျီသြမေတြီကို သင်၏ သန့်ရှင်းစင်ကြယ်မှုပန်းတိုင်များနှင့် ကိုက်ညီရပါမည်။ သင်၏ကော်လံကို electrostatic တပ်ဖွဲ့များကထိန်းချုပ်သည်ဟုဘယ်တော့မှမယူဆပါ။ လုပ်ငန်းစဉ်ကို အပြိုင်အဆိုင်ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံတူသော ညီမျှခြင်းတစ်ခုအဖြစ် သဘောထားပါ။ ဤအသေးစားပတ်ဝန်းကျင်ကို မှန်ကန်စွာထိန်းချုပ်ခြင်းသည် အရွယ်ရောက်နိုင်သော မျိုးပွားနိုင်စွမ်းကို အာမခံပါသည်။

သင်၏လုပ်ဆောင်နိုင်သော နောက်ထပ်ခြေလှမ်းများကို ယနေ့ ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် စတင်ပါ။ ပထမဦးစွာ သင်၏ လက်ရှိသန့်စင်မှုဆိုင်ရာ ပိတ်ဆို့မှုများကို အနီးကပ်စစ်ဆေးပါ။ မြင့်မားသောနောက်ခံဆူညံသံကို သင်ခံစားရပါသလား။ သင်၏ဆေးကြောမှုကြားခံပါဝင်မှုအား ချက်ချင်းပြန်လည်အကဲဖြတ်ပါ။ လူစုလူဝေးကို လွှမ်းမိုးရန် အနည်းဆုံး လိုအပ်သော အိပ်ရာထုထည်ကို သင်အသုံးပြုကြောင်း သေချာပါစေ။ နောက်ဆုံးတွင်၊ သတ္တုမှိုတက်ခြင်းသည် မင်းရဲ့စကေးအားမြှင့်အားထုတ်မှုကို ထိခိုက်စေပါက၊ သင်၏ matrix ကို IDA မှ NTA သို့ ချက်ချင်းပြောင်းပါ။

အမြဲမေးလေ့ရှိသောမေးခွန်းများ

မေး- imidazole အစား သူ့ tagged ပရိုတိန်းတွေကို အဓိပ္ပါယ်ဖော်ဖို့ NaCl (ဆား) ကို ဘာကြောင့် အသုံးမပြုနိုင်တာလဲ။

A- ဆားသည် ရိုးရှင်းသော အိုင်ယွန်နှောင်ကြိုးများကို အနှောင့်အယှက်ပေးသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် Ion Exchange Chromatography တွင် ဆားကို အဓိကအသုံးပြုသည်။ IMAC သည် Lewis acid-base chemistry မှတဆင့် သြဒိနိတ် covalentနှောင်ကြိုးများပေါ်တွင် လုံးလုံးလျားလျားမှီခိုနေပါသည်။ NaCl ၏ ပြင်းအား မြင့်မားသော ဤတည်ငြိမ်သော သြဒီနိတ် ရှုပ်ထွေးမှုများကို ထိရောက်စွာ မချိုးဖျက်နိုင်ပါ။ သတ္တုချည်နှောင်သည့်ဆိုဒ်များအတွက် ယှဉ်ပြိုင်ရန်အတွက် သင်သည် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံအတုယူမှုတစ်ခု လိုအပ်ပါသည်။

မေး- ကျွန်ုပ်၏ပရိုတင်းကို ဖော်ညွှန်းရန်အတွက် အာရုံစူးစိုက်မှုမြင့်မားသော နီကယ်ဖြေရှင်းချက်ကို အဘယ်ကြောင့် မသုံးနိုင်သနည်း။

A- သင်၏ elution ကြားခံရှိ အခမဲ့ Ni2+ အိုင်းယွန်းများသည် အပြုသဘောဆောင်သော အားကိုဆောင်သည်။ သင့်အစေးပေါ်တွင် တည်ရှိသော နစ်ကယ် နစ်ကယ်သည် အပြုသဘောဆောင်သော အားကို သယ်ဆောင်ပါသည်။ ပုံသေ matrix သည် လွတ်လပ်သော အိုင်းယွန်းများကို ပြင်းထန်စွာ တိုက်ထုတ်သည်။ အလကားသတ္တုသည် သင်၏ပစ်မှတ်ပရိုတင်းကို ဘယ်တော့မှမရွှေ့ပြောင်းဘဲ သင့်ကော်လံတစ်လျှောက် တိုက်ရိုက်စီးဆင်းသည်။

မေး- သိုလှောင်ခြင်း/ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် ကျွန်ုပ်၏ Ni-NTA အစေးမှ imidazole ကို မည်သို့ဖယ်ရှားနိုင်မည်နည်း။

A- ပြိုင်ဖက် မော်လီကျူးသည် hexahistidine တက်ဂ်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက နီကယ်အတွက် ဆက်စပ်မှု နည်းပါးသည်။ ကြမ်းတမ်းစွာ ထုတ်ယူသော အေးဂျင့်များ မလိုအပ်ပါ။ ပိုလျှံနေသော ကြားခံများဖြင့် ကော်လံကို သေချာစွာ ဆေးကြောရုံဖြင့် ၎င်းကို အလွယ်တကူ ဖယ်ရှားနိုင်သည်။ ဤအဆင့်ကို ပေါင်းခံရေဖြင့် လိုက်နာပါ၊ ထို့နောက် အစေးကို 20% အီသနောဖြင့် လုံခြုံစွာ သိမ်းဆည်းပါ။