Tirohanga: 0 Kaituhi: Kaiwhakatika Pae Wā Whakaputa: 2026-04-17 Takenga: Pae
Ko nga hua o te purenga pūmua kaore i te rite ki nga kaiwhakahaere taiwhanga kua tau. He maha nga miihini tukatuka o raro e pa ana ki te ngoikore o te ma, te mate ohorere ranei i ia ra. I te nuinga o te wa ka whakawhirinaki ratou ki nga tikanga kawa, kaua ki te whakakoi i nga kukū parepare kia rite ki te matū ruruku motuhake. Ko te Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) e hiahia ana kia tino tika. Ki te kore koe e aro ki nga whakakorikori herenga ahurei o to irapi ngota, ka tupono koe ki nga kohungahunga rerenga mahi. Ka whakakorehia e tenei tuhinga te hononga hanganga taketake i waenga imidazole me te nickel. He pai te whakawhiti mai i nga tikanga ariā ki nga paearu whiriwhiri kapia. Ka kitea e koe he anga-a-whakapapa mo te arotau i nga tikanga whakangao ana-tohu. Ka hipokina ano e matou me pehea te rapu raru i nga rahunga purenga noa. Ma te mohio ki tenei matū tino nui ka huri i nga hua whakamatautau karekau i te matapae ki roto i nga tikanga whakaraerae tino nui, pono.
Hanganga Hanganga: He kaha ake te Imidazole ki nga tohu histidine na te mea ko tana hanganga mowhiti e rima-mema ka mahi hei turanga Lewis kuiti, ka neke tika i te pūmua i whaaia ki nga waahi ruruku nickel.
He mea nui ki te whiriwhiri i te Resin: Ko te pumau o te tauwhitinga nickel-imidazole e tino whakawhirinaki ana ki te herenga chelating e whakamahia ana (hei tauira, 4-dentate NTA te aukati i te rewharewha whakarewa pai ake i te IDA 3-dentate).
Te Kukutanga hei Waea Mana: Ko te whakatangi tika o te imidazole i te wa e herea ana (10–25 mM) ka pehi i te pokanoa pūmua o te kaihautu, i te wa e peia ana e nga kukū teitei (200–500 mM) te haunga i te whaainga.
I tua atu i te Matū: Ko nga ahuatanga o te tinana penei i te 'Saturation Effect' (rōrahi resin vs. pūmua papatipu) he mea tino nui ki te matū parepare mo te whakatutuki i te tino parakore.
He maha nga kaimatai e kii ana ko te kukume hiko e peia ana te herenga pou. Ko tenei pakiwaitara rongonui ka nui haere nga hapa kawa. I te pH-a-tinana, ka noho koretake te histidine. Ko te tauwhitinga pono ka whakawhirinaki katoa ki runga i nga here kovalent. Ka kiia tenei matū waikawa-waahi Lewis. I roto i tenei punaha, ka mahi te nickel immobilized hei kaikawe irahiko. Ko te takirua o nga irahiko kei runga i te ngota hauota te mahi hei koha nui. Me mohio koe ki tenei tikanga kore-katote kia mohio ai koe ki te whakamaarama IMAC. Mena ka rite koe ki te punaha whakawhiti katote, ka kore to purenga.
Ko te ahua o te hanganga te kaupapa matua o te here whakataetae. Titiro tata ki te hangahanga ngota. He rite tonu te ahua o te ngota ngota mahi e whakamahia ana mo te elution ki te mekameka taha kaha o te toenga histidine. He rite tonu te hanganga mowhiti e rima nga mema. Ina whakauru koe i tenei whakataetae kore utu ki roto i te punaha, ka kaha te whawhai mo nga waahi tinana ano. Kaore e taea e te katote nickel te wehewehe i waenga i te mowhiti koreutu me te pūmua kua tohua. He rite tonu nga kanohi tuku irahiko ki te pokapu whakarewa.
Na te mea e whakawhirinaki nui ana te miihini ki runga i nga tauira whakataetae, ka noho noa te kohanga angitu hei keemu tau. Kei a koe te maha o nga waahi here nickel i runga i to kapia. Ka herea te tohu polyhistidine na runga i te awe o nga toenga maha. Heoi, ko te waipuke i te pourangi ka huri te painga pangarau. He kukū nui o te kore utu Ko te imidazole te kaha o te taiao. Ka toa i te tohu na roto noa i te noho mai o te ngota ngota. Ko tenei nekehanga papatipu ka akiaki te pūmua i whäia ki te tuku me te rere i roto i te pou.
Ko te arotake i nga ahuatanga o te chelator e pa ana ki to hua whakamutunga. Ko te kapia tautoko totoka me mau te katote nickel. Ko te waikawa Nitrilotriacetic Paerewa (NTA) e whakamahi ana i nga waahi tuatahi e wha. Ko tenei whakaritenga tetradentate ka mau i te whakarewa. E rua nga waahi whakarite e tuwhera ana mo te tohu histidine. Ko te waikawa Iminodiacetic tawhito (IDA) e whakamahi ana i nga waahi ruruku e toru anake. Ko te IDA te pupuri i te konganuku he nui noa atu. Ka whakawhäitihia e te NTA te riihi nickel e kore e hiahiatia i roto i nga waahanga elution tino kaha. Ko te whakaiti i te riihi konganuku ka noho tonu hei take tautukunga tino nui mo te whakahiato i nga mahi rongoa.
Kei raro ko te tūtohi whakarāpopototanga e whakatairite ana i te hihiri o te hanganga o te kapia IDA me te NTA:
Resin Chelator |
Nga Pae Whakakotahitanga |
Tuwhera Pae mo te Pūmua |
Te Ritenga Ritenga Whakarewa |
|---|---|---|---|
IDA (Wakawa Iminodiacetic) |
3 (Tridentate) |
3 |
Teitei (ina koa ki nga molarities elution teitei) |
NTA (Wakawa Nitrilotriacetic) |
4 (Tetradentate) |
2 |
Iti (ka herea nga konganuku whakawhiti) |
Ko te whiriwhiri i te whakarewa whakawhiti tika ka whakarereke i to taunga tuuturu. Me whakarite e koe te whakarewa ki o whainga o raro. Ko Nickel te tohu o te paerewa ahumahi mo te kaha teitei. He pai te whakahaere i te hopu kaupapa whanui. Ko te Cobalt he ngoikore ake te hononga here. He iti ake te hiahia o te ngota ngota whakataetae ki te whakakore i to whainga mai i te cobalt. Heoi ano, ko te cobalt he tino pai ake te ma ma te paopao pai ki nga pūmua kaihautu papamuri. Ka whakaratohia e te parahi te kaha here nui engari ka tukuna te tino iti rawa. Me rahui te parahi mo nga mahi whakarangatira ngawari penei i te paninga ELISA.
Katote Kotara |
Here here |
Tauwhāiti |
Take Whakamahi Pai |
|---|---|---|---|
Nickel (Ni2+) |
Teitei |
Whakaōrite |
Te hanga pūmua paerewa me te hopu hua nui. |
Cobalt (Co2+) |
Whakaōrite |
Teitei |
Ko nga tono parakore teitei e hiahia ana kia iti te haruru papamuri. |
Konohi (Cu2+) |
Tino Teitei |
Iti |
Nga whakamatautau kume-iho ngawari me te whakarangatira tuatahi. |
Ko te maramatanga o te kaihoko mo nga inenga rōrahi me tino aro koe. He maha nga wa ka warewarehia e nga kaihoko nga korero whakatārewatanga tinana. Ko nga kapia tauhokohoko tata tonu ka tukuna hei 50% whakatārewa wai. I te nuinga o te wa ka rewa ratou i roto i te wairewa whakamaru waiwaro. Kotahi mira o te kupu 'rorahi moenga' me pai koe ki te paipa kia rua mira o te slurry tinana. Ki te kore e whai whakaaro mo tenei ōwehenga ka haurua to kaha herenga ariā tonu. Ko tenei tatauranga he mea tino nui mo te hoko me te mahi whakahiato.
Ko te whakahaere tika i te wa e herea ana me nga waahanga horoi ka wehe i nga purenga pai mai i nga mea pai. Me whakauru koe i nga pota iti i waenga i te 10 me te 50 mM i te wa o te wahanga uta tuatahi. Ko tenei paparanga turanga e noho kaha ana ki nga waahi herea ngoikore. He maha nga wa kei roto i nga pūmua kaihautu endogenous he papa histidine marara. Ko te Bovine Serum Albumin (BSA) me nga immunoglobulins ka herea kore-motuhake mena ka waiho kia kore e tirohia. Ko te iti o te kukū taketake ka mahi hei kaikawe matū. He kaha te aukati i enei poke whakapouri kia kore e piri ki te kopu.
Ko te wahanga elution e hiahia ana ki te neke nui i roto i te hihiri kukū. I te nuinga o te waa me 200 ki te 500 mM ka pakaru te matatini. Ka waipuketia te taiao o te rohe e tenei paepae riri. Kare e taea e te tohu polyhistidine te pupuri i tona pu ki nga miriona ngota ngota whakataetae. Ka taea e koe te whakamahi i tenei kukū hei hikoi ohorere, he rōnaki rārangi ranei. Ko nga hikoi hikoi ka hanga i nga tihi koi engari i etahi wa ka toia nga poke. Ko nga rōnaki raina he pai ake te taumira tihi ina wehe ana i nga momo rereke maha.
Ko nga herenga hototahi matū ka kaha ki te whakahau i to hangai parepare. Ko etahi taapiri noa ka tino whakangaro i te taiao ruruku ngawari. Me ata tirotirohia e koe o lysis buffers i mua i te utaina.
Nga Kaihanga Whakaiti: Kia mau ki te Dithiothreitol (DTT) i raro i te 5 mM. Ko nga moni teitei ake ka whakaiti i te katote whakarewa. Ka kite koe ka huri te kapia ki te tae parauri kino.
Nga Kaiwhaiwhai Kaha: Kia mau te EDTA ki raro i te 1 mM. Ka mahi a EDTA hei chelator hexadentate. Ka tihorea te konganuku mai i te matrix NTA. Ka tino ma te kapia.
Nga Amine Tuatahi: A ape i te parepare Tris mena ka taea. Ko te molarity teitei ka taea e Tris te taunekeneke ngoikore ki te taha o to whaainga, ka whakaheke i nga hua katoa. Whakamahia kētia te konutai phosphate.
I etahi wa ka kore e herea to pūmua whainga. Me tere te wehewehe i waenga i nga rahunga matū me nga rahunga steric. Tirohia to raupapa i te tuatahi. Ka tanumia pea te His-tag ki roto i te uho takai 3D o te pūmua. Ko nga waahi here kaore e tae ki te whakarewa. Waimarie, karekau te matū IMAC e hiahia he pūmua takai hei mahi. Ka taea e koe te huri katoa ki nga tikanga whakaheke. Ko te taapiri i te 8M Urea ka wetekina katoa te pūmua. Ka kitea e tenei te tohu kua tanumia, ka whakaora tonu i te kaha here.
Ko te whakamaaramatanga o mua i te waa horoi e tohu ana i te tino arotautanga. Mena ka horoia to pūmua i mua i te taahiraa whakamutunga, he nui rawa te kaha o to kukū taketake. Ko te ngota ngota kaiwhakataetae kei te neke wawe i to whaainga. Tërä, tirohia tö pH parepare. Ka hinga te hihiko here nui ki te taka pohehe te pH ki raro i te 7.0. Ko te pH iti ake ka protonates i te hauota motuhake takirua. Kia protonated, ka ngaro tona kaha ki te mahi hei turanga Lewis. Manatokohia to pH i muri i te whakakorenga o nga tote katoa.
Ko te maataapono waiwai ka pakaru i te pakiwaitara tauineine noa. Ko te whakamahi i etahi atu kapia kaore e rite ki nga hua pai ake. Ko te tikanga, ko te nui o te kapia ka whakaiti i te ma katoa. Whakaarohia te ahua o te arai aukati penei i te karapu poipapa. Ka taea e te karapu kotahi te pupuri i etahi poi korowha iti. Heoi, kotahi noa te poirewa nui e taea te pupuri. Ka aukati a tinana i nga waahi here e patata ana nga pūmua nui. Me tatau tika te rahinga o te moenga e hiahiatia ana. Ma te whakapoipoi i te kopu ka toia nga whaainga hononga-tiketike ki te whakakore i nga poke ngoikore o te tinana.
Ko te utu pakihi mo nga toenga parahanga ka toro atu ki tua atu o te purenga tuatahi. Ko te kaha o nga kaiwhakataetae e kaha whakararu ana i nga whakamatautau whakararo. Ka takahia e ratou nga mata whakamaarama tairongo. Ka whakararu hoki i nga hanganga rongoa ma te whakarereke i te osmolarity rohe. Kaore e taea e koe te waiho noa i te eluate kia kaua e pa. Me hoahoa koe i tetahi taahiraa tango motuhake kia mau tonu te mahi koiora mo te whakamatautau mahi.
Ko te arotake i nga tikanga tango paerewa me taurite te wa ki te tauine. Ko te whakakorenga pūmua me te whakaheke toto e tohu ana i o whiringa tuatahi e rua. He tino utu te utu mo nga roopu rangahau iti. Ka hiritia e koe te pūmua ki roto i te kiriuhi ahua-permeable ka waiho te whakamaarama hei mahi. Heoi, he maha nga haora e roa ana te whakaheke toto. Ko te whakakore i nga pou e kaha ana te Rahi Whakakore Chromatography (SEC). Ka tere haere nga pūmua nui i roto i te rōrahi kore. Ka mau nga ngota ngota iti ki roto i nga pirepire pore. Ka tukuna e te SEC te tere, ka taea te whakauru mo nga waahi hangahanga arumoni.
Mo nga tono tino tairongo, ka taea e koe te whakamahi rautaki rereke katoa. Ko te tikanga whakangao kore-whakataetae ka hipa katoa i te whakataetae matū. Ka rawekehia e koe te taiao-a-tinana.
Horoi Tuatahi: Whakapaihia te pou kua utaina ki te pH pumau o 8.0 hei tango i nga otaota kore hono.
Whakataka Tuatahi: Whakahekea haeretia te parepare horoi ki te pH 7.4. Ka timata tenei ki te ngoikore i nga taunekeneke kore-motuhake.
Horoi Hohonu: Whakahekea te pH ki te 6.5. Ko nga pūmua manaaki me nga toenga histidine matapōkere ka wetewete ka horoi katoa.
Te Whakamutunga Whakamutunga: Hoatu he parepare elution ki te pH 5.5 ki te 6.0. Ma tenei ka whakakorikori i te tohu polyhistidine. Ka ngaro te tohu i ona ahuatanga turanga o Lewis ka tukuna ma te kore he taapiri ngota ngota whakataetae.
Ko te angitu o te IMAC me whakataurite te matū matū waikawa-waahanga Lewis. Ko te mana rōnaki tika te whakatau i te kounga o to hua whakamutunga. Me whakarite e koe te ahuahanga kapia e tika ana ki o whainga parakore. Kaua rawa e whakaaro ko nga mana hiko e whakahaere ana i to poupou. Me whai i te tukanga hei taurite hanganga whakataetae. Ma te whakahaere tika i tenei taiao moroiti, ka whakamanahia te whakaputa hou.
Ko nga mahi ka whai ake ka timata i te taiwhanga i tenei ra. Tuatahi, arotakehia o waahi pounamu o naianei. Kei te rongo koe i te haruru papamuri teitei? Aromātaitia ano to kuhanga parepare horoi tonu. Me mohio koe ki te whakamahi i te iti rawa o te rahinga o te moenga e hiahiatia ana hei whakamahi i te tini o te tangata. Ka mutu, ki te whakararu te riihi whakarewa i o mahi tauine, whakawhitia to kopu mai i te IDA ki te NTA tonu.
A: Ka pakaru te tote i nga here katote ngawari. Ka whakamahia te tote ki te Ion Exchange Chromatography. Ko te IMAC ka whakawhirinaki katoa ki nga here kovalent ma roto i te matū waikawa-waahi Lewis. Kare e taea e nga kukū teitei o te NaCl te wawahi i enei huinga taunga pumau. Kei te hiahia koe i tetahi tauira hangahanga hei whakataetae mo nga waahi herea whakarewa motuhake.
A: Ko nga katote Ni2+ kore utu kei roto i to parepare elution he utu pai. Ko te nickel kare e noho ana i runga i to kapia he utu pai hoki. Ko te matrix pumau ka panaia nga katote kore utu. Ka rere totika noa te konganuku kore i roto i to poupou me te kore e nekehia atu to pūmua.
A: He iti te hononga o te ngota ngota whakataetae mo te nickel ki te tohu hexahistidine. Kare koe e hiahia ki nga apiha tihorea kino. Ma te horoi noa i te poupou me te nui o te parapara rere ka ngawari te huri. A pee i tenei taahiraa me te wai maturu, katahi ka penapena i te kapia ki roto i te 20% waiwaro.
