Tirohanga: 0 Kaituhi: Kaiwhakatika Pae Wā Whakaputa: 2026-04-24 Takenga: Pae
Ko te Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) ka noho tonu hei paerewa mo te purenga i ana pūmua kua tohua i te ao. Heoi, he maha nga wa e pa ana nga kairangahau ki tetahi raruraru pouri i roto i nga tikanga taiwhanga. Ka kite ratou i te whakahiatotanga ohorere ki raro, te ngaro ohorere o te mahi enzymatic, me te wetewete uaua. Ka whakaaro pea koe mena ka kaha te whakangaro a to reagent elution i to whaainga kua ata whakaatuhia. Ko te mea pono e hiahia ana kia tino marama te maarama. Te matū Ko te imidazole ehara i te denaturant puāwaitanga penei i te Urea me te guanidine. Heoi, he ngawari te whakararu i nga hanganga pūmua i raro i nga tikanga whakamatautau. Ko nga kukū teitei kaore i parea, te ahotea waiariki, te noho roa ranei ka whakararu i nga tauwhitinga pūmua-pūmua tino nui. I hoahoatia e matou tenei tuhinga ki te whakarato i te angamahi marama, i runga taunakitanga mo to taiwhanga. Ka ako koe me pehea te tautuhi tika i te kino o te hanganga i whakaawehia. Ma matou e whakaatu ki a koe me pehea te arotau i o parepare purenga. Ka mutu, ka arotakehia e matou etahi atu papaarangi haumaru ake hei tiaki i nga whakamatautau tairongo o raro.
Paerewa Kukukū: Ko te nuinga o te noho haumaru (50–250 mM) te nuinga o te wa, engari ko nga kukū tino nui (~1M) ka kaha te ahua o te tote e whakararu ana i nga tauwhitinga pūmua-whakawaenga.
Te Whakamate Ngaaariki: Ko nga tauira pūmua koropuke kei roto i te imidazole mo te SDS-PAGE ka mate te waikawa-waa-waahanga o te here, ka puta ki te whakahekenga.
Te Whakararuraru Taatari: Ka kaha te tango a Imidazole i te rama UV i te 280 nm (e hua ana i nga raraunga hua pai) me te whakararu i nga whakamatautau i runga i te parahi (Lowry, Biuret).
Tukatuka Tikanga: Ko te whakawhiti ki nga kapia-a-Cobalt ka whakaheke i te kukū o te imidazole e hiahiatia ana, ko nga matrice Silica/Lysine hou ka whakakore i te hiahia mo te imidazole katoa.
He maha nga wa e uaua ana nga roopu taiwhanga ki te wehewehe i waenga i te koretake o te whaainga maaori me te denaturation-a-buffer-induced. Ma te pohehe i tenei take motuhake ka taupatupatu nga raraunga koiora hanganga. Ka hiahia hoki ki nga mahi whakamatautau nui, e pau ana te wa. Ma te mohio me pehea te paanga o nga kaitarai ki to pūmua ka aukati i enei raru nui.
He tino kawakore nga rongoa kararehe kaore i whakatikatikahia. Ki te kore e tika te whakamaarama i nga parepare elution ka piki ohorere, ka tere te pH i runga i te tono pou. Ko tenei nekehanga nui ka whakaoho i te waahi i roto i te hanganga tuatoru. Ka tere te wehe i nga huinga pūmua ngawari i roto i nga taiao kino. Manatoko i nga wa katoa i to pH parepare i mua i te haere ki tetahi mahi whakamaarama.
Ko te nui o te kukū ka whakauru mai i tetahi atu riri huna huna ki te tapatahi tauira. I te wa e tata ana nga taumata mora ki te 1M, ka noho katoa te otinga hei whakarewa kaha-katote-kaha. Ko tenei huanga 'tiketike-tote' ka pakaru tika i nga taunekeneke hiko ngoikore. Ko nga here polar e tika ana mo te pupuri i nga ahuatanga taketake ka pakaru katoa. Ka huri i te anga whakamakuku e karapoti ana i nga ngota ngota pūmua. No reira, karekau nga taunekeneke pūmua-pūmua nui (PPI) ki te pupuri i nga matatini maha.
Ka mutu, ko te whakamaaramatanga roa i muri i te whakamaaramatanga e whakatairanga ana i te puhoi haere o te ahua. Ko nga pūmua whainga ka heke mai i te otinga i roto i te waa. Ka kite pea koe i te whakahiato taumaha ka puta i te wa o muri mai i te whakaheke toto, i nga waahi rokiroki mo te wa roa. Ko te tukatuka i o hautau kua whakakorehia ka whakawhāiti tonu i tenei matapihi whakakitenga kino. Ko te whakaheke tere ka whakarite kia mau tonu to pūmua i te ahua taketake.
He maha nga wa ka pakaru nga rereke kawa i nga purenga kua oti te mahi. I kitea e matou e toru nga hapa nui o te whakahaerenga i puta ai te whakahekenga kino. Ko te karo i enei hapa ka tino pai ake to riterite o te whakamatautau.
Hapa 1: Kohuatia nga Tauira mo SDS-PAGE.
Ko te Morearea: Ko nga Kairangahau ka kohuatia nga tauira ki te 100°C i mua i te rere o nga ra. Ko nga tauira e koropupu tika ana kei roto i nga kuhanga hauhautanga teitei ka wetewete i nga hononga ngawari-waikawa. Ko nga taumata reagent teitei e tere tere ai tenei hauwai kino. Kaore e kore ka kite koe i te paheketanga o te roopu me te paninga ki runga i nga reera ka puta.
Ko te Whakatika: Whakawhanauhia o tauira ki te 70°C mo te 5 meneti. Ko tenei tikanga whakamahana ngawari ka whakakore i nga pūmua mo te electrophoresis me te kore e pakaru matū. Ka tutuki koe i nga roopu marama, tika e tohu ana i to hua tuturu.
Hapa 2: Te ti'aturi i runga i te Imidazole Concentration ki te Whakatika i nga take poke.
Te Moreatanga: I etahi wa ka panaia e nga Kaimahi nga parepare elution ki tua atu i te 500 mM me te kore e tika. Ka ngana ratou ki te pana i nga whaainga pakeke mai i te pou, kaua ki te arotau ki te here. Ko tenei huarahi taumaha ka tarai i nga katote whakarewa mai i te metalloproteins, ka hangaia he apoproteins kore-mahi. Ka whakanuia ano e ia nga tupono kawa moorearea mo nga whakamatautau i roto-vivo whakararo.
Te Whakatikatika: Whakapai ake i o taahiraa horoi tuatahi, kaua ki te whakanui ake i te kaha o te hau. Whakatauhia te herenga kore-motuhake ma te whakaorite i te rōrahi tīwae (CV) ki te uta pūmua tūturu. Ko te taapiri i te 200–500 mM Arginine he tino pai te pakaru o te hiko o nga poke. Ko te horoi me te 1–4 mM ATP ka tuku angitu i nga chaperone ngota i purea mai i to whainga.
Hapa 3: Kore e aro ki te Histidine Protonation States.
Te Moreatanga: Ko te Waiariki pH ka tino whakahaere i nga miihini here tinana. Ko te whakaheke i te pH kia iti rawa i te wa e herea ana, e horoi ana ranei ka aukati i te whakahekenga nui o te Histidine. Ko te whakatata atu ki te ira isoelectric e arai ana ki te haunga i te wa o mua. Ka taka nga pūmua i te kapia i te iti rawa o te kukū, i etahi wa ka 10 mM noa iho. Ma tenei ka kaha nga kaiwhakahaere ki te whakarereke i nga kawa paerewa mo te hopu noa i o raatau hua. Me whakarite e koe to pH papaa kei runga ake ranei i te 7.5 hei pupuri i nga ahuatanga utu tika.
Me arotake e koe he pehea te hurihanga a te toenga o nga waahanga parepare i nga arotake tātaritanga. Ko nga inenga he ka pakaru i nga waahanga whakamatautau ka whai ake, ka ururua i nga rawa taiwhanga utu nui.
Ahu Aromātai: Tikanga Ine
Ko te reagent e whakaatu ana i nga ahuatanga whakaurunga o te UV tino kaha. Ka hangaia e te 250 mM te papamuri he papamuri $A_{280}$ mai i te 0.2 ki te 0.4. Ko tenei ahuatanga o te tinana ka tino whakanui ake i nga tatauranga whai hua. Ka whakaaro pea koe he nui noa atu te pūmua i mahia e koe i te mea kei roto i te ngongo.
Rautaki Whakatikatika: Me whakawetohia to spectrophotometer i nga wa katoa. Me whakamahi e koe te titonga tika o te parepare elution hei tohutoro tuwhera. Hei tauira, whakawhitihia to rerengamahi ki te whakamatautau Bradford. Ko tenei tikanga a Coomassie-a-Coomassie ka tino kaha ki te whakatete i taua pokanoa whatu motuhake. Me tino karo koe i nga tikanga whakaheke-parahi penei i a Lowry me Biuret assays. Ko te matū ka whakaheke i nga katote parahi, ka nui te rahunga ine.
Ahu Aromātai: Hanganga me te Mahi Mahi
Ka kaha te whakataetae ngota ngota toenga mo nga waahi here-metara ka kitea i roto i nga metalloenzymes matatini. I tua atu, ka taea e raatau te mahi hei kaiwhakararu endocrine kaha i roto i nga whakamatautau koiora i runga i te pūtau, in-vivo ranei. Ko te waiho kia huri haere i roto i to tauira ka whakararu tika i te whaitakenga whaiaroaro me te pono o nga raraunga hanganga.
Kawa Tangohanga: I te wa e arotake ana i te oranga koiora o raro, whakahau kia tangohia nga toenga. Whakamahihia nga pou whakaheke tere-whakakore mo nga waa hurihuri tere. He pai rawa te mahi a te ultrafiltration centrifugal me te dialysis mo te po mo te horoi tino tauira i mua i te whakamatautau enzymatic.
Momo Whakatau |
Taumata Whakararuraru |
Hangaia o te Porearea |
Tohutohu |
|---|---|---|---|
A280 (UV Absorbance) |
Teitei |
He kaha te whakauru o roto i te 280 nm |
Kia noho parakore, karohia ranei |
Bradford (Coomassie) |
Iti |
He iti noa te taunekeneke me te here o te tae |
Tino tūtohutia |
Lowry / Biuret |
Tino kino |
Ka whakaiti i te parahi, te aukati i te huringa tae |
Kaua e whakamahia |
Ko te whakaiti i te puaretanga ka tiakina to hua mahi whakamutunga. Ka taea e koe te arotau i nga tukanga taiwhanga ma te whakamahi i etahi rautaki tino whai kiko, kua whakamatauria.
Otinga Kāwai 1: Hurihia ki nga Pūnaha IMAC I runga i te Cobalt
Ko nga kapia Cobalt e whakaatu ana i te tino taumata teitei ake i whakaritea ki nga matrices Ni-NTA paerewa. Kei a raatau nga paepae hononga iti ake mo nga pūmua kaihautu papamuri. Ko tenei mooni matū motuhake ka taea te hauhanga tino parakore i nga kuhanga reagent tino iti. Ko te tikanga me 150 mM anake koe ki te tuku i te taumata e hiahiatia ana. Ko tenei whakahekenga nui ka whakaiti i te ahotea katoa e pa ana ki nga hanganga o te whaariki.
Otinga Wāhanga 2: Te Whakakore i nga Tikanga Whakakore
Ko etahi o nga pūmua kua tino whakahuahia ka hanga he tinana whakauru korekore. Ko te tukatuka i a raatau me whai tikanga tino kaha ki te aukati. Ko te whakamahi i te 6M Guanidine-HCl, te 8M Urea ranei ka tino tika ki te whakarewa i enei whakahiato.
Tuhipoka whakatinanatanga tino nui: Ko te ngota ngota elution tuatahi e kore e mahi hei kai horoi i roto i enei ahuatanga uaua. Ko nga denaturants taumaha ka whakarereke i te katoa o nga tohu here tinana. Mena ka whakamahi koe i te Guanidine i te wa e purea ana, me tarai e koe te tauira ki te Urea i mua i te whakahaere i te SDS-PAGE. Ko tenei mahi whakahau ka aukati i te whakatioatanga kino ina konatunatua ki nga paatete uta paerewa.
Otinga Kāwai 3: Pūmau Pūmau
Ko etahi o nga huinga maha-waahanga matatini ka noho tino kaha ki te wehe ohorere. Me taapiri tonu koe i nga parepare pure-tahi hei aukati i nga mana whakararuraru i te wa o te wa whakakino. Ko te taapiri i nga whakapumau kore-katote penei i te PEG me te glycerol e whakarato ana i te tautoko hanganga e tika ana. Ko enei taapiri hei whakamarumaru i nga papanga hydrophobic me te pupuri i te pono o te ao puta noa i te oma.
Rautaki |
Painga Tuatahi |
Take Whakamahi Pai |
|---|---|---|
Korahati Resin |
Whakahekea te paepae elution (~150 mM) |
Ko nga whaainga tairongo e kaha ana ki te whakahiato |
Te taapiri Urea/Guanidine |
Whakarewa tinana whakauru |
Te whakapuaki pūmua korekore |
PEG / Glycerol Buffering |
Ka aukati i te wehewehenga uaua |
Nga huinga pūmua maha-iti |
Raruraru Pakihi
Kei te piki haere te tirotiro ture mo te haumaru taiwhanga whanui puta noa i te ao. Ko nga reagents matū tuku iho e kawe ana i te paitini whakawhānau me te whakararu i te endocrine. I tua atu, ko te nui o te utu mo te korenga o te awa na te riihi whakarewa taumaha he tino wero whakahaere. He maha nga wa ka whakangarohia e te konukara nga kaitono pūmua rongoa i nga waahanga whanaketanga o muri mai. Kei te tino hiahia nga whare ki nga rerengamahi haumaru ake hei tiaki i nga kaimahi me nga whakamatautau whakahirahira.
Wāwai Rongoā: Whakatupuranga Silica me Lysine Resins
Paearu Aromatawai: Ko te whakakapi i nga matrices Ni-NTA tawhito ka whakakorea etahi morearea paitini i te wa kotahi. Ko nga matrice-whakatupuranga-silica e whai ake nei e whakamahi ana i nga miihini purenga-whakawaenga-Lysine. Ko tenei whakawhitinga hou ka whakakore i te hiahia nui mo nga reagents mura penei i te waihano i te wa e rokiroki ana mo te wa roa. Ka tutuki i a koe he taiao taiwhanga tino haumaru ake, e tika ana.
Nga waahanga-ki-Putanga: Ka taunekeneke a Lysine me nga whaainga ma te ngawari o te hononga hauwai me nga taunekeneke hiko hiko. E tuku ana i te tino pai o te koiora. Ka taea e nga whainga ki te whakaheke ma te kore e whakawhirinaki ki nga kaihoko whakanekehanga kaha. Ka karohia e koe nga tupono whakahekenga hanganga e pa ana ki nga tikanga nekehanga tuku iho. Ka pau te wa, nga tukanga tango hoha ka ngaro katoa.
Rorotika Whakararangi Poto
Ko nga whare e whakarite ana i te koiora hanganga matatini, te arotakenga pūmua rongoa ranei, ka pa ki nga tono whakamatautau tino kaha. Ko nga hanganga ture mo te hauora me te haumaru (EHS) te mea nui mo nga whakaaetanga a te tari. Me tatau tika nga roopu i te ROI o te neke ki nga tohu rangatira rereke. Ko te whakarite i nga mahi horoi IMAC tuku iho me whakapau kaha me te pau i te nui o te aukati. Te karo Ko te imidazole te nuinga o nga wa e whakakaha ana i te paipa whakaputa katoa. Ka whakapumau i te oranga morahi mo nga whakamatautau whakararo tino tairongo.
I hipokina e matou nga ahuatanga matū tino rerekee o te koretake o te pūmua i whakaawehia. Ahakoa karekau e mahi hei denaturant mo te ao katoa, ko te whakamahinga hee ka pakaru te tika o te pūmua. Ko te nui o te kukū mahi, te whakamahana tauira hee, me te koretake o te tātari whanui ka pakaru nga raraunga whakamatautau utu nui.
Whakaarohia enei waahanga poto, mahi-mahi ka whai ake mo to taiwhanga:
Tirohia o kawa purenga o naianei mo nga hikoi whakangao nui-nui.
Whakakapihia nga tikanga kohua paerewa ki te whakamahana 70°C i mua i te hiko hiko.
Hurihia nga rerengamahi ine whatu whakararo katoa ki nga whakamatautau a Bradford.
Aromātai i te katoa o te kore utu, te iti ranei o nga papaaho matrix mo nga tono whakararo tino tairongo.
A: Ae. Ko te whakamahana i te imidazole-kei roto i nga parepare ki te 100°C mo te SDS-PAGE ka whakamaarama i nga hononga waikawa-waua. Ko te whakamahana i te 70°C mo te 5 meneti ko te huarahi haumaru e taunaki ana.
A: Ko te Imidazole ka kaha te mimiti i te 280 nm. Ka taea e nga kukū o te haunga (hei tauira, 250 mM) te whakaurunga o te papamuri o te 0.2 ki te 0.4, ka puta he korero teitei teka.
A: Ahakoa ka whakamahia e te haupae paerewa te 50–250 mM, ko nga kukū e tata ana ki te 1M ka rite ki te tote teitei, ka taea te whakararu i te taunekeneke pūmua-pūmua me te whakahiato.
A: Mo te pumau mo te wa roa, nga whakamatautau enzymatic, i roto ranei i nga rangahau vivo, me tango te imidazole ma te whakamaarama i nga pou, i te dialysis ranei, na te mea ka roa te rongo ka arahi ki te ua me te paheketanga o te hanganga.
